▲第一作者：张瀛溟; 通讯作者：刘育；

通讯单位：南开大学；

论文DOI: 10.1002/anie.201903243

和10.1002/ange.201903243

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我们合成了苄基咪唑盐共价修饰的微管靶向多肽分子，通过微管靶向多肽—微管蛋白之间的相互作用以及苄基咪唑—葫芦[8] 脲之间的主—客体络合作用来有效调控微管之间的聚集行为，从而诱导细胞凋亡和体内肿瘤的生长抑制。

背景介绍

A. 大环受体调控生物大分子的结构和功能

具有环状空腔的大环受体分子（例如环糊精、杯芳烃、葫芦脲、柱芳烃等）可以通过主—客体非共价相互作用来模拟和调节许多天然生物大分子的结构和功能。其中，利用主—客体特异性分子识别与键合作用机制已成为调节蛋白质—蛋白质相互作用的有效手段。因此，大环分子—蛋白质超分子组装体的多样性和复杂性在控制能量转移、生物催化与传感、形貌相互转换、细胞存活率等方面都显示出了重要的研究价值。在常见的大环主体分子中，葫芦脲因具有低毒性并且能够与多肽序列、有机阳离子和胺类等客体分子组装形成稳定的主—客络合物而备受人们关注。研究发现，将客体分子修饰到蛋白质结构的氮末端，进一步通过葫芦脲识别和键合氮末端的客体分子，能够构筑具有刺激响应性能的蛋白质超分子组装体，这可以在分子水平上实现对生物大分子结构和功能的有效调控。

（参考刘俊秋老师的综述，Chem. Rev. 2016, 116,13571-13632）

B. 微管的聚集和解聚

微管（microtubule，MT）是细胞骨架的关键蛋白组分，它是由球状 α/β-微管蛋白异二聚体以高度动态的方式结合而形成的。微管的聚合和解聚在维持细胞形态、细胞分裂、信号转导及物质输送等过程中起着非常重要的作用。因此，调控并干扰肿瘤细胞内微管蛋白的聚集与解聚行为，能够显著影响肿瘤细胞的有丝分裂过程，从而达到抑制肿瘤细胞生长的目的。由于微管在细胞生长和发育过程中发挥着独特且重要的作用，微管结构已成为肿瘤化学治疗的重要分子靶点和生物分子组装的重要研究对象。

C. 生物靶向肽

微管是许多天然抗癌药物分子的作用靶点，一些能够干扰微管动态稳定性的天然产物，如微管稳定剂和去稳定剂（如紫杉醇、秋水仙碱衍生物、长春花生物碱等）目前已经被广泛用于临床治疗中。这些分子主要通过筛选天然物质获得，尽管这些药物已经取得了良好的治疗效果，但相关耐药性的问题也日益突出；因此，开发新的具有抗耐药性且能够靶向微管蛋白的药物是目前癌症治疗领域的研究重点，以微管蛋白为靶标的生物多肽已成为开发微管靶向药物的首选。

研究出发点

在之前的工作（Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 8649–8653）中，我们将 β-环糊精和偶氮苯基团分别修饰到紫杉醇分子上，利用紫杉醇分子骨架与微管蛋白的特异性结合能力，以及在紫外和可见光照射下偶氮苯分子与 β-环糊精空腔可逆键合的性质，来调控微管蛋白的聚集状态，进而影响细胞活性。虽然该工作能够光控可逆调控微管的聚集与解聚，但由于紫杉醇自身具有较强的细胞毒性，不能够显著突出超分子的非共价键合作用。因此，我们考虑把紫杉醇和偶氮苯替换成能够靶向微管蛋白且无明显细胞毒性的生物多肽分子（参考 Maurizio Sironi 的工作，Nat. Chem. 2009, 1, 642–648），从而希望进一步体现出超分子非共价键合作用对微管蛋白聚集行为的影响。在本工作中，我们设计合成了苄基咪唑盐共价修饰的微管靶向多肽分子 BP，通过微管靶向多肽—微管蛋白之间的相互作用以及苄基咪唑—葫芦[8]脲（CB[8]）之间的主—客体络合作用来有效调控微管之间的聚集，从而诱导细胞凋亡和对体内肿瘤的生长抑制（Figure 1）。

▲Figure 1. Schematic illustration of (BPÌCB[8])@MT ternary supramolecular assembly for targeted microtubular aggregation.

注：由于手机端无法显示部分符号，文中 BPÌCB 应为：

图文解析

A. 葫芦脲和多肽的键合行为研究

首先，通过 1H NMR 氢谱探讨了在非细胞和活体环境中 BP 与葫芦脲之间的主—客体键合行为。核磁质子峰化学位移的变化表明，咪唑盐的正电荷与葫芦脲入口处的羰基氧原子之间通过离子—偶极相互作用，使得苄基咪唑部分被特异性包结在葫芦脲的空腔中，而多肽链部分则位于葫芦脲空腔的外部（Figure 2）。接着，我们通过核磁滴定和等温量热滴定实验进一步研究了 BP 与葫芦脲之间的键合比和键合常数（KS）。发现在 CB[8] 与客体分子 BP 摩尔比为 0.5 处有一个拐点，也就是说 CB[8] 和 BP 之间形成了 1:2 的络合物。最后，实验测得 BPÌCB[8] 络合物的 KS 值高达(5.15 ± 0.04) × 1011 M–2，表明 CB[8] 与苄基咪唑部分具有极强的键合能力。对比实验表明，苄基咪唑部分与葫芦[7] 脲（CB[7]）的包结比例是 1:1，二者之间的 KS 值是(8.66 ± 0.43) × 105 M–1。

▲Figure 2. Partial 1H NMR spectra (400 MHz, D2O, 25 °C) of (a) BPÌCB[8] complex, (b) free BP, and (c) BPÌCB[7] complex ([BP] = [CB[7]] = 1.5 mM and [CB[8]] = 0.75 mM). The asterisk indicates 0.5% acetone as an internal standard at 2.22 ppm in D2O.

B. 葫芦脲—多肽组装体诱导微管体外聚集的研究

随后，我们通过透射电子显微镜直观地研究了 BPÌCB[8] 组装体对微管之间聚集行为的影响（Figure 3）。令人高兴的是，只有 BPÌCB[8] 组装体存在的情况下，微管的形貌可以从纤维状的纳米聚集体专一性地转变为平均直径为 700 nm 的纳米粒子聚集体。电镜结果进一步表明，单独的多肽—微管蛋白相互作用或苄基咪唑—CB[7] 络合物都不足以显著地改变微管的组装和形貌，而 CB[8] 诱导的多价超分子交联作用是诱导微管聚集体形貌转变过程中一个必不可少的因素。与电镜表征结果一致，动态光散射和紫外光透过率实验也证明了 BPÌCB[8] 络合物确实能诱导微管形成尺寸更大的聚集体。在 (BPÌCB[8])@MT 三元体系中，组装体的光学透过率迅速下降；在大尺度范围内，水合动力学直径的分布也迅速变宽。

▲Figure 3. TEM images of (a) free MT, (b) BP@MT, (c) (BPÌCB[8])@MT, (d) (BPÌCB[7])@MT, (e) mixture of MT and BAÌCB[8] complex (initial concentration: [tubulin] = 1.0 mg/mL, [BP] = [BA] = [CB[7]] = 50 μM, [CB[8]] = 25 μM, pH 6.8). The scale bar in each TEM image is 500 nm. (f) Schematic illustration of BPÌCB[8] complex with α- and β-heterodimeric tubulins. The BP peptide was shown in purple.

C. 葫芦脲—多肽组装体诱导细胞内微管聚集的研究

随后，我们研究了 BPÌCB[8] 络合物对人肺腺癌细胞（A549）中微管的诱导聚集能力，从而在体外实现了对细胞增殖的抑制。首先，激光共聚焦显微镜实验结果表明，BPÌCB[8] 组装体能够诱导细胞内微管聚集成球状且细胞形态明显发生异常变化（Figure 4a）。细胞存活率测定实验结果也表明，BPÌCB[8] 络合物具有明显剂量依赖的细胞毒性，在 40~320 μM 广泛的浓度范围内均可以显著增加死亡细胞的比例（Figure 4b 和 4c）。此外，以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参，我们还评估了细胞凋亡相关蛋白酶 caspase-3 的表达。与单独的 BP 相比，BPÌCB[8] 络合物可以导致 caspase-3 的表达量显著上升，表明 BPÌCB[8] 络合物对细胞凋亡有更明显的诱导作用（Figure 4d 和 4e）。细胞实验结果一致表明，BPÌCB[8] 组装体可以严重干扰细胞中微管蛋白的组装过程，并最终主要通过 caspase-3 依赖的途径引起细胞凋亡。

▲Figure 4. In vitro suppression of cellular proliferation by BPÌCB[8] complexation. (a) Confocal fluorescence images of A549 cells incubated with BPÌCB[8] complex. The rhodamine-labelled BP (red) and FITC-tagged antibo{attr}3210{/attr} (green) were used to stain the MT skeleton and DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole, blue) was used to stain nucleus. The typical condensed MTs are indicated by white arrows. Content changes in (b) cell viability, (c) PI-positive cells, (d) ratio of cleaved caspase-3 to GAPDH, and (e) apoptotic cells by BPÌCB[8] supramolecular complexation. Asterisks in (b–e) indicate the statistically significant differences among groups (*p < 0.05).

D. 葫芦脲—多肽组装体抑制小鼠体内肿瘤生长的研究

最后，我们以荷瘤小鼠为模型，研究了 BPÌCB[8] 络合物对小鼠体内肿瘤生长的抑制能力。和预期一样，在所有组别中，BPÌCB[8] 络合物治疗后的小鼠肿瘤体积和重量都是最小的（Figure 5a 和 5b）。此外，脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）也显示，经 BPÌCB[8] 处理后，肿瘤细胞具有更高的凋亡率（Figure 5c）。定量分析还发现，在 BPÌCB[8] 二元超分子组装体处理的肿瘤组织中，TUNEL 阳性细胞的数量最高（约占 44 %），进一步证实了 CB[8] 介导的超分子络合作用在体内诱导细胞凋亡的重要性（Figure 5d）。另外，对比实验也表明，BPÌCB[8] 络合物被证明是产生大量凋亡细胞和抑制肿瘤生长最有效的组合方式。

▲Figure 5. In vivo inhibition of tumor growth for BALB/c mice bearing S180 cancer cells treated with blank control (PBS), BP, and BPÌCB[8] complex, respectively. (a) Time-dependent changes in the relative tumor volume after different treatments (n = 6, mean ± s.d.); (b) representative photograph of tumors at the end of the anticancer experiments; (c) confocal fluorescence images of TUNEL assay of tumor tissues. DNA fragments in apoptotic cells were stained with fluorescein-conjugated deoxynucleotide (green); (d) ratio of TUNEL-positive cells/total cells. Asterisks in (a and d) indicate the statistically significant differences among groups (*p < 0.05). The injected dose was normalized to 0.06 mmol kg–1 BP.

总结与展望

我们合成了苄基咪唑盐共价连接的多肽分子，该分子不仅保留了多肽部分靶向微管蛋白的能力，苄基咪唑部分还为葫芦脲的包结提供了键合位点。接着，我们通过考察组装体的形貌变化，证明了通过多肽—微管蛋白之间的相互作用和主—客体络合作用，可以对微管间的聚集行为进行有效地调控。体内和体外的实验也表明，广泛且多价的超分子交联作用可以促进细胞凋亡，并且能够抑制肿瘤的生长。本工作进一步体现出了在生物纳米组装体系中引入超分子可控协同键合作用的巨大优势，类似的蛋白—蛋白相互作用调控手段也可以为包括癌症在内的其它相关疾病治疗提供全新的策略。