溃疡性结肠炎和克罗恩氏病均为病因不明的慢性非特异性炎症性疾病（inflammatory bowel disease，IBD），多发于结肠。流行病学调查资料显示，IBD在国内外的发病率逐年增高^[1]。由于病因不明、临床易反复发作、无特异性根治措施，IBD被WHO列入难治病症^[2]。

穿心莲内酯为爵床科穿心莲属植物穿心莲Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees中提取得到的二萜内酯类化合物，是穿心莲的主要有效成分之一，具有抗病原微生物、解热、抗炎、改善机体免疫、保肝利胆、抗肿瘤等作用，被誉为天然抗生素药物^[3-6]。研究表明，穿心莲内酯通过抑制核转录因子-κB（NF-κB）与DNA连接发挥抗炎作用，局部灌肠对溃疡性结肠炎和克罗恩氏病具有较好的治疗作用^[5]。目前市售有多种穿心莲内酯的普通口服制剂（如穿心莲片、穿心莲胶囊等），其治疗结肠病变只能经胃肠道消化吸收入血，分布在结肠部位的药物浓度较低，难以发挥局部抗炎疗效，而单纯提高药物剂量又会导致毒性增加。临床上虽有采用灌肠给药方式，但灌肠给药极不方便，临床应用受到极大限制。

pH依赖型结肠靶向多单元释药系统^[7-11]是针对人体胃肠道不同部位具有不同pH环境，通过包裹pH敏感型包衣材料，使制剂不溶于上消化道而仅在结肠部位溶解释放的制剂。相比于常规口服一单元释药系统，pH依赖型结肠靶向多单元释药系统可使药物在结肠部位定点释放，增加局部药物浓度，多单元释药系统增加与结肠部位接触面积，进一步提高了药物的作用，制剂受个别单元释药影响小，保证了制剂的释药行为的一致性。

质量源于设计（quality by design，QbD）是以预先设定的目标产品质量特性为研发起点，在了解关键物质属性和关键工艺参数基础上，建立能满足产品性能且工艺稳健的设计空间，根据设计空间，建立质量风险管理，确立质量控制策略和药品质量体系^[12-16]。本实验基于QbD理念研究穿心莲内酯结肠靶向释药微丸的处方与工艺，为炎症性肠炎的临床治疗提供新的选择。

1  仪器与材料

Waters-UPLC超高效液相色谱系统，Waters公司；BS210S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；S220pH计，梅特勒-托利多公司；Agilent 708 DS全自动溶出仪，安捷伦科技有限公司；YQ300-2气流粉碎机，上海赛山粉体机械制造有限公司；Mini250型低温挤出滚圆机，深圳信宜特公司；FBM3-15沸腾制粒包衣机，浙江小伦制药机械有限公司。穿心莲内酯，批号151005，质量分数＞98.0%，成都通德药业有限公司；穿心莲内酯对照品，含量测定用，批号110797-201108，质量分数＞99.7%，中国食品药品检定研究院；盐酸、磷酸二氢钠、氢氧化钠、磷酸二氢钾、磷酸，天津风船化学试剂有限公司；十二烷基硫酸钠（SDS），西格玛公司；甲醇、乙腈，色谱纯，欧姆尼科技有限公司；微晶纤维素（MCC），批号1507011，旭化成株式会社；卡拉胶GP911NF，批号60113051，上海商贸公司；泊洛沙姆188，批号WPAK524B，巴斯夫公司；尤特奇L100（批号B140907231）、L30D-55（批号B140814378）、S100（批号B140705004），德国赢创工业有限公司；交联羧甲基纤维素钠（艾迪速），批号TN14827344，FMC BioPolymer公司；羧甲基纤维素钠（CMS-Na），批号20150534，湖州展望药业有限公司；卡拉胶（食品级），批号1510027，徐州丰瑞生物科技有限公司。

2  方法与结果

2.1  建立穿心莲内酯结肠靶向释药微丸的目标产品质量概况（quality target product profile，QTPP）与关键质量属性（critical quality attributes，CQA）

通过相关研究文献的调研，结合前期药理实验，确定本制剂的剂型设计、规格、包装形式等，建立了穿心莲内酯结肠靶向释药微丸的QTPP，见表1。

根据表1中穿心莲内酯结肠靶向释药微丸的QTPP，结合前期预试验的经验，识别建立本制剂的CQA，见表2。

2.2  穿心莲内酯结肠靶向释药微丸的制备

穿心莲内酯结肠靶向释药微丸采用挤出滚圆法制备丸芯后，包衣，装胶囊。先将处方量的穿心莲内酯、泊洛沙姆与卡拉胶混合均匀，加入处方量的纯化水制软材，采用挤出滚圆机将软材以30 r/min的转速挤出后滚圆（第1段转数为500 r/min，滚圆10 s；第2阶段转数为900 r/min，滚圆50 s）。滚圆后的微丸平铺在不锈钢托盘中在烘箱中60 ℃条件下干燥4 h，过筛后流化包衣，装1号胶囊。

同法制备不含穿心莲内酯的结肠靶向释药微丸胶囊，即得空白制剂。

2.3  穿心莲内酯的定量测定

2.3.1  色谱条件 采用Waters超高效液相色谱仪；色谱柱为Waters Acquity UPLC HSSC₁₈（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温50 ℃；体积流量0.5 mL/min；进样量2 μL；检测波长225 nm；流动相A为称取磷酸二氢钾0.14 g，加1 000 mL超纯水溶解，加0.5 mL磷酸，混匀，滤过，即得，流动相B为甲醇-乙腈（10∶90）；梯度洗脱程序见表3。

2.3.2  对照品溶液的制备  称取穿心莲内酯对照品15 mg，精密称定，至100 mL量瓶中，加甲醇适量，超声25 min，放冷至室温，并加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.3.3  供试品溶液的制备  取本品内容物30 mg，精密称定，至100 mL量瓶中，加甲醇适量，超声25 min，放冷至室温，并加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.3.4  专属性试验  取按“2.2”项下方法制备的空白溶剂、空白制剂及穿心莲内酯对照品溶液、供试品溶液，分别照“2.3.1”项下色谱条件测定，色谱图见图1。结果表明，在本色谱条件下，辅料及溶剂对穿心莲内酯的测定无干扰。

2.3.5 线性关系考察  精密量取穿心莲内酯对照品储备液，用甲醇稀释成10.0、40.0、100.0、200.0、300.0、500.0 μg/mL的对照品溶液，摇匀，滤过。按“2.3.1”项下色谱条件测定。以穿心莲内酯对照品溶液质量浓度（X）对峰面积（Y）进行线性回归，得回归方程Y＝8 907 294.289X－9 364.743，r＝0.999 9；可见穿心莲内酯在10.0～500.0 μg/mL线性关系良好。

2.3.6  重复性试验  取本品9份，按“2.3.3”项下方法制备含量水平为70%、100%、120%的供试品溶液各3份，按“2.3.1”项下色谱条件测定。结果本品中穿心莲内酯含量的RSD为0.57%，表明方法重复性较好。

2.3.7  中间精密度试验  取本品，分别由2名不同人员于不同日期按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定。结果穿心莲内酯质量分数的RSD为1.03%，表明方法中间精密度良好。

2.3.8  准确度试验  为扩大本方法准确度验证的范围，按制剂处方量的70%、100%、130%精密称量穿心莲内酯对照品及处方量的空白制剂，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定，计算回收率。结果高、中、低3个质量浓度的供试品中穿心莲内酯的平均回收率为98.49%，RSD为1.1%，回收率良好。

2.4  释放度测定

取本品，采用《中国药典》2015年版通则0931溶出度与释放度测定法第二法，即桨法测定。释放介质选择0.1 mol/L盐酸溶液500 mL，pH 6.0磷酸盐缓冲液（PBS）900 mL，pH 7.2 PBS 950 mL。根据食物在人体内的转运时间，设置本品在0.1 mol/L盐酸溶液2 h（100 r/min），在pH 6.0 PBS 1 h（100 r/min），在pH 7.2 PBS 4 h（50 r/min），计算累积释放率。

2.5  单因素考察

本实验以释放度或制剂成型性为评价指标，先对丸芯的处方工艺与包衣剂种类进行单因素考察。

2.5.1  助溶剂种类的选择  本实验结合挤出滚圆法应用经验，对泊洛沙姆188、乳糖、PEG6000、L-HPC、艾迪速及CMS-Na作为助溶剂进行了考察，按照“2.2”项下方法制备丸芯，测定其在pH 7.2 PBS中1 h的释放率，结果见表4。泊洛沙姆188对本处方的助溶效果最好，其表面活性剂作用极大促进穿心莲内酯从丸芯中的溶出。

2.5.2  赋形剂种类的选择  根据助溶剂选择实验结果及历史研究文献，本实验对卡拉胶为基础的赋形剂进行了考察。结果见表5。在卡拉胶GP911NF中加入泊洛沙姆188后可明显改善其释放度。

2.5.3 联合赋形剂比例的选择  结合《药用辅料手册》原著第4版，卡拉胶、泊洛沙姆的安全性项下用量要求，对卡拉胶GP911NF、泊洛沙姆188的处方比例进行筛选研究，见表6。综合收率、堆密度、脆碎度、释放率等结果，本项目优选丸芯处方为卡拉胶GP911NF-泊洛沙姆188（20∶10）。

2.5.4  挤出转速的考察  挤出转速分别为20、30、40、50 r/min，按照“2.2”项下方法制备制剂，评价制剂成型性，结果见表7。挤出转速采用30 r/min时，出条顺畅，速度适中，不发热。

2.5.5  滚圆转速的选择  根据预试验滚圆第1阶段转速为500 r/min，持续10 s，可达到软材条均匀分布，在此基础上，对第2阶段滚圆转速与持续时间进行考察，结果见表8。滚圆第2阶段转速为900 r/min，持续时间为50 s时成丸效果最好，丸径均匀，且无细粉。

2.5.6  包衣剂型号的选择  本研究中选择可在结肠pH值环境下溶解的包衣材料对丸芯进行包衣，测定其体外释放度。结果见表9。结果显示单独使用尤特奇S100醇溶性包衣材料时，本品可在胃液环境中保持极少的释放，待制剂转移至结肠部位时快速释放。

2.6  危害分析与关键控制点法筛选包衣关键因素

本研究中采用分析法危害分析与关键控制点法（hazard analysis and critical control point，HACCP）进行包衣关键因素的筛选。请5位制剂研究员对包衣过程各影响因素进行危害分析，选择对制剂释药行为风险最高的关键因素进行优化研究。结果见表10。结果显示增塑剂用量、包衣增重与老化时长为关键因素。

2.7  星点设计-效应面法优化包衣工艺

通过HACCP分析法筛选出对穿心莲内酯结肠定位释放微丸释药行为影响显著的3个包衣参数：增塑剂用量（X₁）、包衣增重（X₂）与老化时长（X₃）。以该3个因素为考察对象，以酸阶段（0.1mol/L HCl）-缓冲盐阶段（pH 6.0）累积体外释放率（Y）为评价指标，根据星点设计的原理，每因素设5水平，用代码值−α、−1、0、1、α来表示［3因素星点设计的α＝(2³)^1/4］。代码值所代表的实际操作物理量见表11。利用星点设计-效应面法对穿心莲内酯结肠定位释放微丸包衣工艺进行优化。因素水平、处方优化试验安排及结果见表11。

本研究以酸阶段（0.1 mol/L HCl）-缓冲盐阶段（pH 6.0）累积体外释放率（Y）为因变量对各因素进行多元线性回归和2项式拟合，多元线性回归：Y＝b₀＋b₁ X₁＋b₂ X₂＋b₃ X₃，2项式拟合：Y＝b₀＋b₁ X₁＋b₂ X₂＋b₃ X₃＋b₄ X₁²＋b₅ X₂²＋b₆ X₃²＋b₇ X₁X₂＋b₈ X₁X₃＋b₉ X₂X₃。根据结果分析多元线性回归：r＝0.220 3，P＝0.250 9。但拟合度不佳，预测性较差，因此线性模型不适合，故采用2项式拟合。2项式拟合负相关系数r＝0.869 5，P＝0.002 2，各项方差结果见表12。从表12中可见，选择二项式拟合模型为成功模型，实测值与预测值基本吻合，模型具有较好的预测性。多元线性回归Y＝  −19.069 06－1.803 95 X₁－0.108 37 X₂－2.799 80 X₃；2项式数学模型：Y＝85.119 35－17.195 80 X₁－4.701 10 X₂＋2.583 72 X₃＋0.025 500 X₁X₂＋3.800 00 X₁X₃＋2.400 0 X₂X₃＋1.081 98 X₁²＋0.044 693 X₂²－28.791 76 X₃²。

2.8  优化包衣工艺验证

变量曲面图是三维图，只能表达含2个自变量的函数，因此固定3个变量之一为中值，以拟合的目标函数为数学模型。应用Design-Expert8.0软件分析，绘制因变量曲面图（图2）。

根据Design Expert 8.0实验设计软件综合评价后给出的最佳包衣条件为增塑剂用量为3 g，包衣增重为20%，老化时长为1 h。以优化的最优工艺按照“2.2”项下制备3批穿心莲内酯结肠靶向释放微丸，按照“2.4”项下测定制剂的释放度，结果见表13和图3。

3批验证与模型优选的最佳工艺条件在酸阶段（0.1 mol/L HCl）-缓冲盐阶段（pH 6.0）体外累积释放率平均值依次为6.9%、6.6%，相对平均偏差为2.2%，差异较小，说明模型预测性良好。

3  讨论

HACCP是一个系统的、前瞻性的和预防性的用于设计并确保产品质量、可靠性和安全性的方法。它是一个结构化的方法，应用技术和科学的原理分析、评估、预防和控制风险或与设计、开发、生产和产品有关的危害的负效应^[17]。将HACCP分析法应用在本研究中，可有效地筛选出本制剂的关键质量参数，并进行有针对性的试验设计，可显著提高制剂工艺设计的质量与效率。

根据《中国药典》2015年版通则9013《缓释、控释和迟释制剂指导原则》规定结肠定位制剂指在胃肠道上部（pH＜7）基本不释放、在结肠内大部分或全部释放的制剂。本研究的目标为通过pH依赖型包衣材料保证制剂能够达到结肠部位进行释放，因此，在胃肠道上部的释放度将直接影响制剂的释药特性，故选择酸阶段（0.1 mol/L HCl）-缓冲盐阶段（pH 6.0）累积体外释放率为指标，依据试验设计对增塑剂用量、包衣增重、老化时长3个关键因素进行筛选，保证制剂能够顺利通过胃肠道，最终到达结肠定位释放。

本实验采用QbD理念，以多单元释药微丸剂型为预先设定的目标产品，设计其质量特性作为研究的基础，在系统了解关键物料属性和关键工艺参数的基础上，结合单因素考察、HACCP分析法及星点设计-效应面法^[18-20]进行实验设计，系统研究了穿心莲内酯结肠靶向释放微丸的处方及生产工艺中的各参数，完成了从丸芯处方、制备工艺到包衣材料的筛选及包衣工艺的研究，最终获得穿心莲内酯结肠靶向制剂最优处方组成及制备工艺，并完成了3批制剂工艺验证。基于QbD理念的本研究结果将对该制剂的生产实践提供重要的参考。相信随着新的药用辅料的增多、制备技术及相关设备的改进，该剂型在择性定位、停留并作用于靶部位方面的表现将更加优秀。

来源：中草药杂志社

参考文献（略）