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三萜是一类基本母核由30个碳原子组成的化合物，其广泛分布于自然界，是植物重要的一类次生代谢产物。三萜具有多种生物活性，其不仅可以在植物体中防御病虫害[1]，而且具有降糖、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、骨保护等作用[2-11]，是许多药用植物的活性成分，被广泛用于药物、化妆品、食品等行业[12]。常见的三萜主要为四环三萜和五环三萜2类。四环三萜从结构上分为6类，分别是葫芦烷型、达玛烷型、羊毛脂烷型、环阿屯烷型、甘遂烷型及楝烷型。五环三萜的类型较多，主要的五环三萜为齐墩果烷型、乌苏烷型、羽扇豆烷型和木栓烷型4类[13]。由于三萜的结构相对复杂，在植物中含量较低且多种结构相似的化合物常混合存在，通过植物提取分离或化学合成方法获得大量单体三萜化合物较难，三萜的获取限制了其应用[14]。合成生物学为获取大量高价值天然产物提供了新思路，然而通过合成生物学方法得到三萜化合物首先需要解析其生物合成途径。

2,3-氧鲨烯是三萜生物合成的前体物质，其在氧鲨烯环化酶（oxidosqualene cyclases，OSCs）的作用下形成不同类型的三萜碳骨架，细胞色素P450单加氧酶（cytochromeP450 monooxygenases，CYP450）进一步对三萜骨架进行修饰产生结构多样的三萜，部分三萜在糖基转移酶（UDP-glycosyl- transferases，UGTs）的作用下引入糖基生成复杂多样的三萜皂苷[15]。CYP450与三萜的多样性密切相关，因此，CYP450的克隆和功能研究对解析三萜生物合成途径有着重要作用。三萜是许多药用植物的活性成分，其生物合成途径是近年研究的热点，随着分子生物学及合成生物学的发展，三萜的生物合成途径研究取得了新的进展，大量新的参与植物三萜生物合成的CYP450被发现[15-19]。本文以三萜为例，重点对参与药用植物中三萜生物合成的CYP450功能研究进行综述，以期为三萜生物合成途径的进一步解析及CYP450的功能研究提供参考。

1  CYP450的分类

CYP450是植物代谢中最大的酶家族，约占植物基因组编码基因的1%，其具有广泛的催化活性，参与苯丙烷类、生物碱、萜类、脂类、氰苷类、植物激素等植物初生和次生代谢产物的生物合成，其主要参与氧化反应[18-22]。CYP450的分类主要依据其氨基酸同源性，同源性大于40%为同一基因家族，同源性大于55%则为同一亚家族[22]。目前，植物中已发现127个CYP450家族，根据系统发育树上的不同分支，127个CYP450家族被分为11个簇（clan），其中CYP51、CYP74、CYP97、CYP710、CYP711、CYP727、CYP746为单家族簇，CYP71、CYP72、CYP85、CYP86为多家族簇[22]。然而，CYP450的分类仅仅只能代表系统进化关系，与其功能无必然关系[23]。

CYP450参与植物三萜骨架修饰[19]，目前，发现与三萜结构修饰有关的CYP450主要分布于CYP51簇的CYP51H亚家族，CYP71簇的CYP71A、CYP71D、CYP81Q、CYP93E和CYP705A亚家族，CYP72簇的CYP72A、CYP714E和CYP749A亚家族，CYP85簇的CYP87D、CYP88D、CYP88L、CYP708A、CYP716A、CYP716C、CYP716E、CYP716S、CYP716U、CYP716Y、CYP90B和CYP90G亚家族及CYP86簇的CYP94N亚家族。

2  参与三萜生物合成的CYP450

2.1  甘草皂苷生物合成相关CYP450

甘草皂苷为齐墩果烷型皂苷，是甘草的活性成分，同时也是甘草味甜的物质基础。甘草中已发现10多种甘草皂苷，其中甘草甜素（glycyrrhizin）是其主要成分[24]，具有抗炎、抗菌、保肝等多重药理活性[25-27]。由于甘草甜素的特殊甜味，其还被广泛用作甜味剂和调味添加剂[28]。科研人员对甘草皂苷的生物合成进行了大量研究[28-32]。β-香树脂醇（β-amyrin）是甘草皂苷生物合成的前体，其C-3、11、22、24、29和30位在CYP450作用下氧化后与糖基缩合形成甘草皂苷[24]，目前甘草中已报道4个参与甘草皂苷生物合成的CYP450，即CYP88D6（AB433179）[28]、CYP72A154（AB558153）[31]、CYP93E3（AB437320）[28]和CYP716A179（LC157867）[32]（图1）。

CYP88D6具有β-香树脂醇-11-氧化酶活性，可氧化β-香树脂醇和30-羟基-β-香树脂醇（30-hydroxy β-amyrin）的C-11位分别生成11-羰基-β-香树脂醇（11-oxo-β-amyrin）和30-羟基-11-羰基-β-香树脂醇（30-hydroxy-11-oxo-β-amyrin）[28]。CYP72A154进一步对11-羰基-β-香树脂醇的C-30位进行3步连续氧化生成甘草次酸（glycyrrhetinic acid），参与甘草甜素的合成[31]。酵母体内实验结果表明，CYP72A154还可氧化β-香树脂醇的C-30位生成30-羟基-β-香树脂醇，此外，体外酶促实验和酵母体内实验均表明CYP72A154为多功能酶，能氧化D和E环上不同位置的碳原子，与甘草皂苷的多样性密切相关[31]。CYP93E3则能氧化β-香树脂醇的C-24位生成24-羟基-β-香树脂醇（24-hydroxy-β-amyrin）[28]。Tamura等[32]将CYP716A179在酵母工程菌中异源表达，结果表明CYP716A179为C-28位氧化酶，其能氧化α-香树脂醇（α-amyrin）、β-香树酯醇及羽扇豆醇（lupeol）的C-28位分别生成乌苏酸（ursolic acid）、齐墩果酸（oleanolic acid）和桦木酸（betulinic acid）。

2.2  人参皂苷生物合成相关CYP450

人参皂苷是人参、西洋参、三七等人参属植物的重要活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗糖尿病和抗疲劳等多重活性[33-34]。人参皂苷根据结构主要分为达玛烷型和齐墩果烷型2种类型[35]。已报道3个参与人参皂苷生物合成的CYP450：CYP716A47（新命名为CYP716U1，JN604536）[36]、CYP716A53v2（新命名为CYP716S1，JX036031）[37]和CYP716A52v2（JX036032）[38]（图2）。

2.2.1  参与达玛烷型人参皂苷生物合成的CYP450  达玛烯二醇（dammarenediol II）是达玛烷型四环三萜皂苷生物合成的基本前体，其在CYP450和UGTs等的作用下形成达玛烷型人参皂苷。Han等[36-37]采用酵母表达系统对CYP716A47和CYP716A53v2进行功能研究，CYP716A47为原人参二醇合酶，氧化达玛烯二醇的C-12位生成原人参二醇（protopanaxadiol），CYP716A53v2则进一步氧化原人参二醇的C-6位生成原人参三醇（protopanaxatriol），CYP716A47和CYP716A53v2参与达玛烷型皂苷生物合成过程中2个连续的氧化反应，研究人员还利用农杆菌介导转化的方法在烟草中共表达人参达玛烯二醇合酶（PgDDS）、CYP716A47和CYP716A53v2，在转基因烟草的叶片中检测到了达玛烯二醇、原人参二醇和原人参三醇，在烟草体系中进一步验证了PgDDS、CYP716A47和CYP716A53v2的功能[39]。

2.2.2  参与齐墩果烷型人参皂苷生物合成的CYP450  β-香树脂醇是齐墩果烷型五环三萜皂苷的前体，其在CYP450和UGTs等的作用下形成齐墩果烷型人参皂苷。Han等[38]通过酵母表达系统对CYP716A52v2进行功能研究，CYP716A52v2具有β-香树脂醇-28-氧化酶活性，氧化β-香树酯醇的C-28位生成齐墩果酸，在人参中过表达CYP716A52v2显著提高齐墩果烷型人参皂苷（人参皂苷Ro）的含量，说明CYP716A52v2是人参中齐墩果烷型三萜皂苷生物合成的关键酶。

2.2.3  人参皂苷生物合成相关CYP450在合成生物学中的应用  人参皂苷生物合成途径中CYP450的功能研究为“人参酵母”的获得提供了可能性。Dai等[40]将人参的PgDDS、CYP716A47和拟南芥的细胞色素CYP450还原酶基因（AtCPR）整合到酿酒酵母染色体中，并通过密码子优化、过表达tHMG1、ERG20和ERG9增加角鲨烯和2,3-氧化角鲨烯的供应，最终获得了高产原人参二醇的酵母工程菌株（原人参二醇的质量浓度为1 189 mg/L）。在此基础上，Dai等[41]将人参中的β-香树脂醇合酶基因、CYP716A53v2、CYP716A52v2与PgDDS、CYP716A47同时导入酵母中，获得了能同时产生原人参二醇、原人参三醇和齐墩果酸3种人参皂苷苷元的酵母工程菌，为利用合成生物学方法生产人参皂苷奠定了基础。

2.3  罗汉果苷和葫芦素生物合成相关CYP450s

罗汉果苷和葫芦素为葫芦烷型四环三萜皂苷，主要存在于葫芦科植物中[42]，药理研究表明，二者均具有抗癌活性[43-45]。罗汉果苷是罗汉果的主要活性成分，还具有降血糖、抗炎、抗氧化、抗疲劳等生物活性[46-49]，同时也是罗汉果味甜的物质基础，具有甜度高、热量低的特点[50]，是糖尿病患者和肥胖者食品的良好添加剂[51]。

葫芦二烯醇（cucurbitadienol）是葫芦烷型四环三萜皂苷生物合成的基本前体，其在环氧化酶（epoxide hydrolase）、CYP450、酰基转移酶（acetyltransferase）及UGTs等的作用下形成罗汉果苷和葫芦素等化合物[52-53]。目前已报道10个与葫芦烷型皂苷生物合成相关的CYP450：CYP88L4[53]、CYP87D18[53-54]、CYP87D20（KM655862）[42]、CYP81Q59[42]、CYP88L2（NM_001308937）[55]、CYP81Q58（KM655856）[55]、CYP89A140[55]、CYP87D19[55]、CYP712D8[55]和CYP88L3[55]（图3）。

2.3.1  参与罗汉果苷生物合成的CYP450  罗汉果中已报道参与罗汉果苷生物合成的CYP450有CYP87D18[53-54]和CYP88L4[53]。Zhang等[54]将酵母中表达的CYP87D18与葫芦二烯醇进行反应，结果发现CYP87D18能连续氧化葫芦二烯醇的C-11位生成11-羟基葫芦二烯醇（11-hydroxy cucurbitadienol）和11-羰基葫芦二烯醇（11-oxo- cucurbitadienol）。为进一步验证CYP87D18的功能，将CYP87D18与葫芦二烯醇合成酶基因（SgCbQ）和细胞色素还原酶基因（CPR）在酿酒酵母中进行共表达，产物中除检测到了11-羟基葫芦二烯醇和11-羰基葫芦二烯醇之外，还检测到了11-羰基- 24,25-环氧葫芦二烯醇（11-oxo-24,25-epoxycucurbitadienol）。Itkin等[53]研究发现，CYP87D18能氧化24,25-二羟基葫芦二烯醇（24,25-dihydroxycucurbitadienol）的C-11位而生成11,24,25-三羟基葫芦二烯醇（mogrol）。CYP87D18为多功能酶，对葫芦二烯醇、24,25-环氧葫芦二烯醇（24,25-epoxy cucurbitadienol）和24,25-二羟基葫芦二烯醇的C-11位均具有氧化活性[53-54]。CYP88L4为葫芦二烯醇- 19-氧化酶，氧化葫芦二烯醇的C-19位生成19-羟基葫芦二烯醇（19-hydroxy cucurbitadienol）[54]。

2.3.2  参与葫芦素生物合成的CYP450  黄三文课题组[42,55]对黄瓜、甜瓜和西瓜中葫芦素类化合物的生物合成进行了深入研究，利用酵母单杂和RNA干扰（RNA interference，RNAi）对黄瓜中8个候

选CYP450进行研究，结果发现，其中7个CYP450（CYP81Q58、CYP89A140、CYP87D19、CYP712D8、CYP88L2、CYP88L3和CYP87D20）均参与葫芦素C的生物合成，进一步利用合成生物学方法对CYP450的催化功能进行研究，CYP88L2与罗汉果中的CYP88L4的功能一致，均氧化葫芦二烯醇的C-19位生成19-羟基葫芦二烯醇，CYP81Q58则进一步氧化19-羟基葫芦二烯醇的C-25位生成19,25-二羟基葫芦二烯醇（19,25-dihydroxy cucurbitadienol）[55]。CYP87D20是葫芦素生物合成中的多功能氧化酶，同时存在黄瓜、甜瓜和西瓜中，其序列同源性较高且催化功能一致，能催化葫芦二烯醇的C-11位和C-20位，生成11-羰基葫芦二烯醇和11-羰基-20β-羟基-葫芦二烯醇（11-oxo-20β-hydroxy cucurbitadienol）[42]。在西瓜和甜瓜中还发现了与葫芦素B和葫芦素E生物合成相关的CYP81Q59，将CYP81Q59转入产11-羰基-20β-羟基葫芦二烯醇的工程菌中验证其催化功能，CYP81Q59能氧化11-羰基-20β-羟基-葫芦二烯醇的C-2位生成11-羰基- 2β,20β-二羟基-葫芦二烯醇（11-oxo-2β,20β- dihydroxy cucurbit- tadienol）[42]。

2.4  桔梗皂苷生物合成相关CYP450

桔梗皂苷为齐墩果烷型皂苷，是桔梗的主要活性成分，目前已从桔梗中分离得到70多种桔梗皂苷[56]。现代药理研究表明，桔梗皂苷具有抗肿瘤、抗炎、降糖、调血脂、保肝和调节免疫等多种药理活性[56-60]。根据桔梗皂苷D（platycodin D）的结构推测，CYP450在β-香树脂醇的C-28位引入羧基并氧化β-香树脂醇的C-2β、16α、23、24位生成桔梗皂苷元[61]。目前桔梗中已报道4个参与桔梗皂苷生物合成的CYP450：CYP716A140（KU878853）[12]、CYP716S5（KU878856）[12]、CYP716A140v2（LC209199）[61]，CYP716A141（KU87885，LC209200）[12,61]（图4）。

Miettinen等[12]将光果甘草的β-香树酯醇合酶（GgGAS）、蒺藜苜蓿的CYP450还原酶（MTR1）及候选基因在产2,3-氧鲨烯的酵母工程菌中共表达，结果表明，CYP716A140具有β-香树脂醇-28-氧化酶活性，可氧化β-香树脂醇的C-28位生成齐墩果酸。CYP716S5催化β-香树脂醇生成12,13α-环氧-β-香树酯醇（12,13α-epoxy-β-amyrin）及质荷比（m/z）为586的一个化合物，在共表达CYP716A140和CYP716S5的体系中检测到2个相对{attr}2695{/attr}为473.362 2的化合物，分别为12α-羟基-β-香树脂醇-13,28β-内酯（12α-hydroxy β-amyrin- 13,28β-lactone）和12,13α-环氧齐墩果酸（12,13α- epoxy oleanolic acid），12,13α-环氧齐墩果酸可自发形成12α-羟基-β-香树脂醇-13,28β-内酯，说明CYP716S5能催化β-香树脂醇及齐墩果酸的C-12,13α环氧化反应及某一位置的羟基化。Tamura[61]发现CYP716A141为多功能酶，不仅能催化β-香树脂醇C-16β生成16β-羟基-β-香树脂醇（16β-hydroxy β-amyrin），还能催化β-香树脂醇的C-28生成齐墩果酸，并且在共表达CYP716A141和CYP716A140的体系中还检测到了m/z688的化合物，根据其相对分子质量推测其为16β-羟基齐墩果酸（16β-hydroxy oleanolic acid），说明CYP716A141可能还能催化齐墩果酸的C-16β位。CYP716A140v2的催化功能与CYP716A140的一致[61]。

2.5 参与乌苏烷型皂苷生物合成的CYP450 

乌苏烷型三萜皂苷生物合成的基本前体为α-香树酯醇，目前报道的CYP450主要参与乌苏烷型皂苷元C-2α、3、6β、16α、22α、23和28位的氧化（表1和图5）。

2.6  参与羽扇豆烷型皂苷生物合成的CYP450

羽扇豆烷型三萜皂苷的基本前体为羽扇豆醇，CYP71D353（KF460438）主要参与羽扇豆烷型皂苷C-20和28位的氧化 [79]，其他已报道的CYP450主要参与羽扇豆烷型皂苷C-2α和28位的氧化（表1和图6）。

2.7 参与其他齐墩果烷型皂苷生物合成的CYP450 

齐墩果烷型皂苷合成的基本前体为β-香树酯醇，其在CYP450等后修饰酶作用下生成齐墩果烷型三萜皂苷。目前，已报道大量与齐墩果烷型皂苷生物合成的相关CYP450，主要参与齐墩果烷型皂苷C-2α、2β、3、6β、12、13β、16、22、23、24、28、30位的氧化，参与其他齐墩果烷型皂苷生物合成的CYP450见表2和图7。

2.8 参与其他三萜生物合成的CYP450

CYP450除参与乌苏烷型、羽扇豆烷型、齐墩果烷型、达玛烷型和葫芦烷型三萜的生物合成外，还参与其他三萜化合物的生物合成，在拟南芥[75,93-95]、藜芦[96-97]等植物中已报道多个参与其他三萜生物合成的CYP450（表3和图8）。

3  结语及展望

CYP450参与植物三萜骨架修饰，对三萜的多样性起着关键作用。随着合成生物学的发展，酵母基因工程菌已成为研究CYP450功能的重要工具，CYP450在植物三萜代谢中的作用研究取得了重大进展。已报道的与三萜生物合成相关的CYP450属于CYP51、CYP71、CYP72、CYP85和CYP86簇。参与乌苏烷型皂苷生物合成的CYP450属于CYP72和CYP85簇，除CYP714E19（CYP72簇）外，其他均属于CYP716家族；参与羽扇豆烷型皂苷生物合成的CYP450属于CYP71和CYP85簇，其中仅CYP71D353为CYP 71簇，其余均为CYP716家族基因（除CYP716C49为桦木酸-2α-羟化酶外，其余均为羽扇豆醇-28-氧化酶）。已报道的参与葫芦烷型皂苷生物合成相关CYP450为CYP712D、CYP89A、CYP81Q、CYP87D和CYP88L亚家族基因，属于CYP71和CYP85簇；参与齐墩果烷型皂苷生物合成的CYP450属于CYP51、CYP71、CYP72和CYP85簇，其中仅参与燕麦皂苷生物合成的CYP51H10属于CYP51簇，在豆科植物中发现的参与齐墩果烷型皂苷生物合成的CYP93E及CYP72A、CYP714E和CYP749A亚家族基因分别属于CYP71和CYP72簇，其余均属于CYP85簇（除CYP87D16外，均属于CYP716家族）。CYP716家族基因广泛参与五环三萜的生物合成，能氧化五环三萜C-2、3、6、12，13、16、22、28多个位点。

CYP450是三萜生物合成的关键基因，且是造成三萜苷元多样性的重要原因，CYP450的克隆和功能研究具有重要科学意义和应用价值，对三萜的生物合成途径解析及合成生物学应用起着关键作用。目前预测CYP450的功能仍具有一定难度，因此需要进一步开展CYP450的克隆及功能研究，解析三萜生物合成途径，为最终通过基因调控实现不同单体三萜的异源生产奠定基础。

来  源：朱灵英，郭  娟，张爱丽，王宝婕，曾礼芳，徐福荣，马晓惠. 参与植物三萜生物合成的细胞色素P450酶研究进展 [J]. 中草药, 2019, 50(22):5597-5610.

来源:中草药杂志社