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<section>▲第一作者：刘珍君；通讯作者：夏江 通讯单位：香港中文大学 论文DOI：10.1021/acsnano.9b04554 全文速览 本文提出了一种用于构建新型多酶催化结构的多功能自组装策略。作者利用谍标签（Spytag）和谍捕手（Spycatcher）的自发反应，以及聚酮合酶对接结构域（Docking Domains, DDs）的正交反应，巧妙地将生物合成途径中的多种酶组装到合成蛋白骨架上，并自组装形成两种多酶催化纳米结构。该策略有效地提高了以甲基萘醌生物合成级联反应为例的产物产率。 背景介绍 在自然界中，细胞会利用多酶复合物来调控生物合成途径，如丙酮酸脱氢复合物（PDCs）和I型脂肪酸合成酶 FAS-1。受此启发，多酶组装技术应运而生，并迅速发展。多酶组装拉近了催化连续反应中酶与酶之间的距离，可提高中间转移效率，隔离有毒中间体，最大限度地减少代谢串扰，简化通量并提高产品产量。 另一方面，基于蛋白骨架的多酶组装方法，具有可遗传编码性，可更好模拟天然复合物，逐步成为生物合成界的宠儿。然而，大多数蛋白骨架仅具有单一结构且组装所用的反应接头都较为累赘，限制了它们在实际工业生产中的应用。 研究出发点 作者以弹性蛋白样多肽（ELP）为骨架主干，将谍标签和谍捕手安装在首尾两端，通过两者特异性共价反应，构建出两种稳定的蛋白结构：异质交联骨架及均质环形骨架。同时对接结构域 DDs 首次在体外被应用为多酶的组装交互模块。DDs 可灵活地将生物合成途径中酶有序组装在蛋白骨架上。该工作综合了谍化学和天然对接结构域的优点，所创建的两种多酶催化纳米结构通过不同的动力学机理大大提高了生物级联催化反应的产率。 图文解析 图一展示了两种蛋白骨架的构成以及多酶组装的简单流程。其中，两个片段蛋白（片段 A 两端为 SpyTag，片段 B 两端为 SpyCatcher）自发反应形成不同长度的蛋白链，随后通过链间的物理相互作用缠绕扩增并自组装形成交联蛋白骨架。另一片段蛋白两端分别融合 SpyCatcher 和 SpyTag，分子内首尾交联形成环状蛋白骨架。而不同来源的对接结构域组，一端（cDDs）嵌入蛋白骨架上，另一端（nDDs）与酶的N端融合，实现了灵活有序将酶组装到不同蛋白骨架上。该方法具有通用性，可更好模拟天然生物催化合成反应。 
▲图1.（A）基于交联蛋白骨架多酶组装的示意图；（B）基于环形蛋白骨架多酶组装示意图。生物酶在该蛋白骨架上的组装可以改变其多聚状态，图以 MenD (绿色标注)为示例说明。 图二以甲基萘醌（维他命 K2）的体外生物合成为应用实例，将本文组装策略用于该途径。作者改造了级联反应中两个关键的酶 MenD 和 MenH，在同样的催化条件下，比较了两个反应组（交联组装和环形组装）以及对照组（游离酶）的反应物消耗速率，产物生成速率以及多酶催化产率。通过实验得知，两个反应组都提高了维他命K2的催化速率，并且产物产率分别达到了 93.7 % 和 94.4 %。 
▲图2.多酶组装体的催化活性比较：（A）.甲基萘醌生物合成途径;(B).产物 SHCHC 的生成对比；（C）.合成反应的催化产率比较；（D）反应物 chorismate 的消耗对比 图三展示了该生物代谢途径中限速酶 MenD 的酶动力学情况研究。结果表示，两种组装结构的酶催化效率 (kcat/KM) 都约为游离酶的两倍。然而，两者实现的途径却不同。交联组装结构增加了 MenD 在催化环境中的密度，提高了底物与活性位点的撞击机会。而相较之，MenD 在环形组装结构仍处于离散状态，但通过了未知的机制提高了酶的催化效率，Kcat 值增加了 77 %。 
▲图三. 限速酶 MenD 催化反应的酶动力学探究：（A）.动力学模拟实验和参数计算；（B）. 不同组装系统的酶机制的简单示意图 图四通过透射电镜（TEM）直观地展示了多酶自组装纳米结构的形貌。 其中，交联蛋白骨架在 1 小时内迅速形成不同尺寸的纳米团簇，团簇间不断缠绕，大小粗细随时间不断扩增。而 MenD 与环形蛋白骨架上形成了一颗颗均匀分布的纳米颗粒球。有趣的是，在大多数（76.6 %）纳米颗粒球中 MenD 都被稳定成为对称的三聚体形态。 
▲图四.蛋白骨架组装体的透射电镜表征：（A）.交联蛋白骨架在不同时间点的透射电镜表征；（B）.环形蛋白与 MenD 组装体的透射电镜以及 2D 分类表征 总结与展望 如何设计精密的多酶催化结构以获得高催化效率，一直是酶工程领域重要的问题。本文作者模拟天然多酶复合物设计了一类独特的多酶组装纳米结构。该策略成功将酶组装在蛋白骨架上并提高了级联酶促反应的效率。这些研究加深了我们对多酶组装的理解，也有效地为纳米技术提供了与酶学相关的一种可能性。 参考文献 1. Kang W.; Liu J.; Wang J.; Nie Y.; Guo Z. Cascade Biocatalysis by Multienzyme–Nanoparticle Assemblies. Bioconjugate Chem. 2014, 25, 1387-1394. 2. Yin, L.; Guo, X.; Liu, L.; Zhang, Y.; Feng, Y. Self-Assembled Multimeric-Enzyme Nanoreactor for Robust and Efficient Biocatalysis. ACS Biomater. Sci. Eng. 2018, 4, 2095-2099 3. Wang R.; Yang Z.; Luo J.; Hsing I. M.; Sun F. B12-Dependent Photoresponsive Protein Hydrogels for Controlled Stem Cell/Protein Release. Proc. Natl. Acad. Sci. 2017, 114, 5912-5917 文章链接： https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.9b04554
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