磷酸三酯化学法合成寡脱氧核糖核苷酸

通过磷酸三酯策略进行ONs在可溶性载体上的开创性合成。尽管这种偶联化学很少用于固体载体，其中小分子试剂和废物可通过简单洗涤除去，但由于使用P（V）合成物而避免氧化步骤显着简化了偶联循环。在溶液合成的情况下，这是显着的优点，其中必须通过更费力的技术除去过量的试剂和废物。第一次合成一个相当长的ODN，即。八角体d（5'-TAGCGCTA-3'）由Bonora等人进行。[37]关于聚乙二醇（PEG 5000）单甲酯。整体策略与固体支持化学的策略非常相似（方案2）。因此，3'-末端核苷，5'- ø -DMTr- Ñ 6 -BZ-DA，经由3'-琥珀酰基连接体附着于载体，5'- ö用3％TCA除去-DMTr组在DCM和衍生的支持由沉淀分离，用Et 2 O和重结晶从1：DCM和Et的9（v / v）混合物2 O. 5'- ø -DMTr核苷（3.0当量的dT特区的Bz然后，使用1-（均三甲苯基-2-磺酰基）-3-硝基-1将dG ibu，dG Dpa，dA Bz）作为3' - （2-氯苯基磷酸酯）在吡啶和2,6-二甲基吡啶的混合物中偶联，2,4-三唑（MSNT; 6当量）作为活化剂和N. - 甲基咪唑（NMI; 10当量）作为亲核催化剂。每次偶合后，从EtOH中沉淀/重结晶，用Ac 2 O在吡啶中封端，并从DCM / Et 2 O中沉淀。尽管有几次沉淀和重结晶，一个偶联循环可在5小时内完成，逐步偶联产率范围从90％到95％，得到粗PEG结合的八聚体，产率为79％。然而，dG ibu的偶联以超过100％的收率进行，这被解释为副产物形成的指示。显然，MSNT活化导致O6被3-硝基-1,2,4-三唑-1-基取代[38]。通过在二恶烷[39]和氨水中用顺式 - 联吡啶-2-羧基肟和四甲基胍连续处理将低聚物从载体上释放并脱保护，并通过DEAE纤维素上的离子交换色谱法纯化。从980mg粗PEG-八聚体中，得到85mg纯的冻干的dA（5'-TAGCGCTA-3'）TEA盐。换句话说，分离步骤的产率小于30％。

为了避免在MSNT处理期间改变dG ibu，通过最初由Marugg等人引入的1-羟基苯并三唑活化。[40]然后尝试了相同的PEG支持[41]。因此，使用常规保护的2'-脱氧核苷（3当量）的3' - （2-氯苯基苯并三唑-1-基磷酸酯）作为结构单元，并且在存在下在吡啶和二恶烷的混合物中进行偶联。 NMI（5当量）。否则，该协议与前一个协议类似。组装八聚体d（5'-TAGCGCTA-3'）时的平均逐步偶联产率为93.5％，并且可以以纯脱保护形式分离55％的PEG-锚定的寡聚物。现在没有检测到碱基修饰反应。

基于羟基苯并三唑活化的磷酸三酯方法最近应用于在支链四- O- [4-（叠氮基甲基）苯基]季戊四醇衍生的载体上合成短ODN （方案3）[42]。由于载体的对称结构，在链组装的任何阶段都可以进行NMR和质谱表征。通过Cu（I）催化的1,3-偶极环加成[4]，将3'-末端核苷作为3'- O-（4-戊炔基）衍生物固定在该载体上。该载体可溶于MeCN和二恶烷，但在MeOH中定量沉淀。每个偶联循环包含两个沉淀，一个在去除5'- O之后-DMTr组和耦合步骤后的第二组。用HCl在MeOH和DCM的1：1（v / v）混合物中催化脱三苯甲基化，并在NMI存在下在二恶烷中进行偶联。通过用MeOH稀释10倍来实现沉淀。所有小分子化合物都保留在溶液中。用（E的四甲基胍盐）除去2-氯苯基保护基）在含水二恶烷中的2-硝基苯甲醛肟，然后进行氨解，通过沉淀除去载体并转化为钠盐，完成合成。在每个偶联步骤中使用2当量的结构单元，以55％的产率获得通过HPLC均相的五聚体d（5'-CGCAT-3'）。这种四足支持物的优点似乎是良好的原子经济性，即与所获得的ORN的量相比少量的载体材料和适当消耗支持物结合的寡核苷酸所需的溶剂（MeOH）。然而，到目前为止，只有短的低聚物在这种支持物上制备。载有较长完全受保护的低聚物的载体可能较少定量沉淀，或链间聚集可能降低偶联效率。

另外加入Q-连接基部分[44]的密切相关的支持物6已被用于制备完全受保护的ODN三聚体，其仅具有未保护的3'-末端羟基功能，因此可用于一步转化为亚磷酰胺构建物。阻止[45]。这种亚磷酰胺广泛用于通过寡核苷酸定向诱变组装可用于蛋白质工程的ODN [46-49]。在DCM，二恶烷和MeOH的3:43:10混合物中用5mmol L -1 K 2 CO 3裂解接头（30分钟），然后用氯化吡啶鎓中和，留下5'- O-DMTr基团，2-氯苯基磷酸酯保护和碱基部分保护未受影响。用1-氯-1-（2-氰基乙氧基）-N，N-二异丙基亚磷酰胺进行硅胶色谱纯化和常规亚磷酰化得到所需的结构单元，证明其在固相合成中的适用性[45]。已经在相关的可还原裂解的二硫键连接的载体7 上制备了用于磷酸三酯偶联的受保护的三聚体ODN的3'-（2-氯苯基）磷酸酯[50]。