在可溶性载体上合成寡核苷酸

寡核苷酸通常借助于全自动合成仪以实验室规模在固体支持物上制备。扩大设备使工业合成达到千克规模。尽管如此，溶液相合成一方面受到关注，一方面作为一种技术可以实现更大量的合成，另一方面，作为克级实验室合成而无需任何特殊设备。可溶性载体上的合成被认为是可以结合溶液和固相合成的有利特征的方法。该方法的关键步骤是在每次偶联，氧化和去保护步骤后，将支持物锚定的寡核苷酸链与单体结构单元和其他小分子试剂和副产物分离。迄今应用的技术包括沉淀，萃取，色谱和纳米过滤。关于偶联，所有常规化学品，即。亚磷酰胺，已经尝试了H-膦酸盐和磷酸三酯策略。虽然基于P（III）的亚磷酰胺和H-膦酸盐化学物质几乎专门用于固体载体，但“过时的”基于P（V）的磷酸三酯化学物质仍然为可溶性载体上的合成提供了一个主要优点。省略氧化步骤简化了耦合循环。为可溶性支持的合成开发的几种方案允许在没有任何特殊设备的情况下以克规模制备有限长度的DNA和RNA寡聚体，显然对于需要大量用于研究目的的寡核苷酸的研究组感兴趣。然而，他们都没有真正按照这样的规模进行测试，以至于可以严格判断其工业用途的可行性。

关键词： DNA; 寡核苷酸; RNA; 可溶性载体; 合成

寡核苷酸（ONs）的合成包括通过磷酸与一个的3'-OH和另一个核苷的5'-OH的酯化以特定的顺序将核苷彼此连接。通常，首先用适当的磷酸衍生物酯化3'-OH，然后使得到的结构单元与5'-OH反应（图1）。可以使用线性或收敛策略，但是从ON的3'到5'末端开始的逐步线性方法现在几乎完全被利用[1,2]。偶联反应可以在磷的氧化水平III或V下进行。由于P（III）中心的反应性较高，适当保护的核苷3' - （2-氰乙基-N，N）-dialkylphosphoramidite）S（1在方案1中）或3'-（ħ -膦）类通常是优选的作为构造块[3] （2在方案1）。攻击5'-OH，所有其他亲核官能团必须在偶联期间保持受到保护。核碱基的伯氨基通常用酰基保护，单体结构单元的5'-OH用4,4'-二甲氧基三苯甲基（DMTr）保护，或者有时用其单甲氧基三苯甲基类似物（MMTr）[4,5]保护。

为了实现偶联，亚磷酰胺用唑类[6]活化，如四唑[7]，其衍生物2-乙基 - 和2-苄基硫代四唑[8]或4,5-二氰基咪唑[9]。活化剂具有双重作用，即向离去的二烷基氨基团提供质子并作为磷上的阴离子物质进行攻击[10]。核苷H-膦酸盐又原位转化为反应性混合酸酐与酰氯或氯磷酸盐[11-13]。在应用亚磷酰胺化学时，得到的亚磷酸三酯在每个偶联循环中被氧化成磷酸三酯，而H - 膦酸二酯可以足够稳定以仅在链组装的末端被氧化。当联接在P（V）级别进行，3'-二酯arylphosphate（3在方案1）通常被用作结构单元和在辅助亲核催化剂存在下与芳基磺酰氯或偶氮杂环活化[14] ，或具有催化活性的磷酸酯保护基，如4-甲氧基-1-氧-2-吡啶甲基组[15] ，来代替非参与arylphosphate组（4在方案1）。或者，预制或原位活化的1-羟基苯并三唑3'-芳基磷酸三酯可用于在亲核催化剂存在下偶联[16,17] （5在方案1）。

与寡脱氧核糖核苷酸（ODN）相比，寡核糖核苷酸（ORN）的合成由于存在另外的亲核官能团而变得复杂，即。只要在寡核苷酸的合成和去保护过程中需要碱性条件，就必须保护2'-OH。由于磷酸酯保护基团通常是碱不稳定的并且可重复除去的5'- O保护基团是酸不稳定的，因此2'- O-保护应该优选在正交条件下可除去。为此目的，已经提出了许多保护基[18,19]，氟离子不稳定的叔丁基二甲基甲硅烷基（TBDMS）[20]）和三异丙基甲硅烷氧基甲基（TOM）[21]最广泛使用的群体。否则，合成策略类似于ODN。

寡核苷酸化学合成的真正突破是Beaucage和Caruthers在20世纪80年代早期的发现，根据该发现，适当保护的核苷可迅速偶联为3' - （O-烷基-N，N-二烷基亚磷酰胺）至5'。通过使用四唑作为活化剂，支持结合核苷的-OH [7]。从那时起，这种固体支持的亚磷酰胺化学几乎专门用于制备从实验室规模[3,22]到工业合成至千克规模的寡核苷酸[23]。尽管该方法取得了明显的成功，但在溶液相中的合成作为大规模合成的替代方法已经获得了持续的兴趣，并且最近在开发靶向前mRNA的治疗性寡核苷酸方面取得了进展[24,25]，成熟mRNA [26-28]或非编码microRNA [29,30]甚至增加了这种兴趣。已经反复论证：（i）溶液中的合成可以用较少过量的结构单元进行，（ii）按比例放大程序将更简单并且（iii）不需要昂贵的固体载体材料。此外，在每次偶联后通过质谱或NMR光谱表征生长链的可能性是一个有吸引力的特征，尽管对于所有可溶性载体都不可能。虽然已采取大规模固相技术的重大进展，但解决方案和固体支持中构件的消耗量差异不一定与先前假设的一样大; 基于亚磷酰胺化学的合成已经优化到只需要适度过量，1.5-2.0当量的构建块的水平[23]。显而易见的挑战是在每个偶联循环后将支持物锚定的ON链与小分子试剂分离，可以通过简单洗涤在固体支持物上进行。沉淀，色谱，萃取和纳滤已被认为是可行的方法。

即使可溶性载体上的合成不能与工业固相合成竞争，它仍然可以在达到克级实验室合成中起重要作用，因为通常不需要特殊设备。例如，通过其他生物聚合物，小分子或金属络合物对ON的结构，动力学和识别的光谱研究可能消耗实验室规模的固相合成器不能方便地达到的量的ON。除了在可溶性载体上合成外，还报道了经典的会聚合成[31-34]以及溶液中固体支持试剂的开发的令人印象深刻的例子[35,36]。然而，本综述仅调查了可溶性载体上ON合成的进展。