亚磷酰胺化学合成寡脱氧核糖核苷酸

如上所述，亚磷酰胺化学现在是小规模和大规模的固体支持的寡核苷酸合成的选择方法。在可溶性载体上应用亚磷酰胺化学合成的第一次尝试可以追溯到1993年。支持（PEG）和链组装的整体策略都在Bonora等人的开创性研究中。[51]类似于先前通过磷酸三酯方法合成ODN的那些。换句话说，通过从Et 2 O中沉淀并从MeCN和Et 2的混合物中重结晶，将载体结合材料与低分子量物质分离。O.在这种情况下，在每个偶联循环中需要四个沉淀/重结晶步骤：脱三苯甲基化，偶联，封端和氧化（方案4）。结构单元是碱基部分保护的5'- O -DMTr-核苷3 ' - （2-氰基乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺），即用于标准固体支持合成的那些。每次与MeCN中的叔丁基氢过氧化物偶联后，亚磷酸三酯被氧化成磷酸三酯[52]。在MeCN中使用2.5当量的亚磷酰胺嵌段和10当量的四唑作为活化剂，获得98-99％的偶联产率。支持物结合的八聚体DMTr-d（5'-TAGCGCTA-3'）-PEG可以以93％的产率获得，20聚体以85％的产率获得。这些产率令人惊讶地高，每个偶联循环需要99％的产率。通过常规氨解释，然后通过酸解脱乙酰化和通过沉淀除去PEG-载体的释放/去保护被报道使纯八聚体的产率比磷酸三酯方法高50％。

基本相同的方法后来应用于PEG缀合的12聚体反义ODN [53]和13聚体富含嘌呤的三螺旋形成序列的合成[54]。然而，通过琥珀酰基连接体固定3'-末端核苷被直接亚磷酰胺与PEG的末端OH偶联所取代，这在氨解脱保护时产生稳定的磷酸二酯键。换句话说，ODN在生物学研究中用作PEG-缀合物。另外，双官能化PEG在一端带有酸不稳定的DMTrO基团，另一端带有碱不稳定的Fmoc-NH官能团，已被用作可溶性载体以获得寡核苷酸-PEG-肽缀合物[55,56]。。首先除去Fmoc保护基团，并将肽组装在暴露的氨基酸功能上。由于肽部分不含酸不稳定侧链保护，因此可以通过上述方案组装寡核苷酸序列。

已经用于合成ODN的另一种沉淀载体是上文讨论的四足-O- [4-（叠氮基甲基）苯基）]季戊四醇衍生的载体[43]。在每个偶联循环中进行两次来自MeOH的沉淀：一次在5'-O-脱三苯甲基化后，第二次在偶联/氧化步骤后进行（方案5））。在严格控制的条件下，用HCl在MeOH和DCM的1：1（v / v）混合物中进行脱三苯甲基化。用略微过量的吡啶中和酸。为了防止三苯甲基碳阳离子使暴露的5'-OH重新三苯甲基化，避免了油性残留物的长时间加热。从MeOH中沉淀定量除去痕量的DMTr碳阳离子，为甲醚。使用标准亚磷酰胺结构单元（1.5当量）和4,5-二氰基咪唑（DCI，1.5当量）作为活化剂，在DMF和MeCN的1：1（v / v）混合物中进行偶联。通过常规的碘氧化将所得的亚磷酸酯三酯转化为磷酸酯。通过用MeOH稀释进行沉淀除去所有痕量的试剂和单体核苷衍生物。作为概念证明，五聚体，d（5'-AGCCT-3'），组装完毕。通过常规氨解作用释放和去保护低聚物伴随着载体的沉淀。通过HPLC均相的五聚体以43％的产率获得。