通过亚磷酰胺化学合成寡核糖核苷酸

三种不同的方案，均基于通过沉淀从低分子量化合物中分离支持物结合的寡核苷酸，已被用于通过亚磷酰胺化学合成寡核糖核苷酸。即易溶于THF，氯仿高度疏水的支持3和DCM，但在MeOH，MeCN中，EtCN不溶的，已被用于组装在克规模一个21-聚体RNA序列[61] （方案9）。首先，用DCM中的DCA除去DMTr基团，并从MeOH中沉淀出脱三苯甲基化的载体。受碱基部分保护的（A Pac，G iPac，C Ac）5'- O -DMTr-2'- O -TBDMS-核苷3' - （2-氰基乙基-N）然后，使用5-（苄硫基）-1H-四唑作为活化剂，将N-二异丙基亚磷酰胺（1.5-2.0当量）在1:10的MeCN和DCM混合物中偶联。在偶联完成后，通过在DCM中加入2-丁酮过氧化物在同一罐中进行磷酸酯的氧化。用MeOH稀释使载体沉淀。然而，对于15-21-mer低聚物，一些载体结合的材料保留在溶液中并通过吸附到C18涂覆的硅胶上而回收。通过DCM中的DCA（3％）脱三苯甲基化完成该循环。裂解和去保护是常规的：在EtOH水溶液中进行氨解，然后用Et 3 N（HF）3在N-甲基吡啶酮（NMP）中进行去甲硅烷基化并除去5'-O -DMTr含有aq TFA（2％）。考虑到合成涉及超过60个步骤，分离的产率（26％）令人惊讶地高。事实上，据报道，完全受保护的序列以46％的产率获得，这相当于每个偶联循环98％的产率。显然，载体上缺乏酰胺氢对于所需的溶解性质是必不可少的，因为用乙二胺8取代连接体结构内的哌嗪片段给出了相当不令人满意的结果。

当用4-羧甲基苯甲酸连接基9取代琥珀酰基连接基时，可以通过催化氢化释放完全受保护的低聚物。这允许制备适当保护的二聚体和三聚体结构单元，其仅具有未保护的3'-末端羟基官能团，因此受磷酸化[62]。

terapodal tetrakis- O - [4-（叠氮基甲基）苯基]季戊四醇衍生的载体也已用于合成短ORN [63]（方案10）。使用异常的2' - O-（2-氰基乙基）-5'- O-（1-甲氧基-1-甲基乙基）核糖核苷3'-亚磷酰胺，因为常见的市售结构单元太疏水而不能沉淀来自MeOH的支持物结合的寡核苷酸。1-甲氧基-1-甲基乙基可以在MeOH中进行酸催化的酯交换反应，作为丙酮的二甲基缩醛定量除去。3'-末端核苷以3'- O连接到载体上 - （4-戊炔基）衍生物，基本上与2'-脱氧核糖核苷一样。通过0.015mol L -1 HCl在MeOH中酸催化除去5'- O -1-甲氧基-1-甲基乙基基本上与DMTr基团一样快，并且不需要额外的清除剂来推动反应。完成。从冷MeOH中沉淀出载体是定量的。亚磷酰胺嵌段以50％过量使用，并且在N 2下，在MeCN和DMF（1：1，v / v）的混合物中用DCI促进偶联。。通过常规的含水碘处理将得到的亚磷酸三酯氧化成磷酸三酯。通过浓缩至油并随后从冷MeOH中沉淀，将载体与所有小分子试剂分离。最后，用三乙胺，氨和TBAF对载体结合的ORN进行连续处理。用NaOAc从EtOH中沉淀完全去保护的ORN。得到六聚体5'-ACGUUU-3'，产率54％，这意味着平均偶联产率为86％。

当5'- Ô -DMTr -2'- ö -TBDMS使用受保护的构建块[64] ，从MeOH代替两个沉淀，每个偶联循环涉及从水中沉淀一个和一个快速色谱法（方案11）。用HCl在MeOH和DCM的2：5（v / v）混合物中进行脱三苯甲基化。用吡啶中和酸，将混合物浓缩至油状物，并在硅胶上进行快速柱色谱。对于随后的偶联，使用50％过量的所需商业嵌段和DCI作为活化剂。标准I 2之后氧化后，载体结合的物质从水中沉淀出来。沉淀是定量的，但是一些试剂和副产物，尤其是DCI，与载体共沉淀。然而，在下一次脱三苯甲基化后的快速色谱法去除了这些杂质。值得注意的是，疏水性载体极大地促进了色谱分离。完成链组装后，用Et 3 N处理，然后氨解，最后用Et 3 N（HF）3处理，释放出ORN，其用NaOAc从冷MeOH中沉淀。通过该方法，制备五聚体5'-AGCUU-3'，产率为46％。

当5'- Ô -DMTr -2'- ö -TBDMS使用受保护的构建块[64] ，从MeOH代替两个沉淀，每个偶联循环涉及从水中沉淀一个和一个快速色谱法（方案11）。用HCl在MeOH和DCM的2：5（v / v）混合物中进行脱三苯甲基化。用吡啶中和酸，将混合物浓缩至油状物，并在硅胶上进行快速柱色谱。对于随后的偶联，使用50％过量的所需商业嵌段和DCI作为活化剂。标准I 2之后氧化后，载体结合的物质从水中沉淀出来。沉淀是定量的，但是一些试剂和副产物，尤其是DCI，与载体共沉淀。然而，在下一次脱三苯甲基化后的快速色谱法去除了这些杂质。值得注意的是，疏水性载体极大地促进了色谱分离。完成链组装后，用Et 3 N处理，然后氨解，最后用Et 3 N（HF）3处理，释放出ORN，其用NaOAc从冷MeOH中沉淀。通过该方法，制备五聚体5'-AGCUU-3'，产率为46％。