抗生素耐药性有可能在全球范围内有效治疗微生物感染。这种情况促使学术界和制药业寻找新的抗菌化合物。在这里，我们报告广泛使用的抗肿瘤药物顺铂如何被重新利用作为对医院病原体铜绿假单胞菌的有效抗菌药物。发现顺铂有效杀死铜绿假单胞菌菌株。在这些实验中，转录组学分析显示recA基因的上调，已知这对于DNA修复是重要的，暗示顺铂可能干扰铜绿假单胞菌中的 DNA复制。。顺铂治疗显着抑制III型分泌系统（T3SS），其对外毒素的分泌很重要。此外，还证明顺铂在小鼠角膜炎模型中根除体外生物膜和体内生物膜。这表明顺铂可以有效地用于根除生物膜感染，否则传统抗生素难以治疗。虽然顺铂在全身暴露时对人体具有高毒性，但局部治疗证明其毒性很低。这表明顺铂的高于最小抑制浓度（MIC）剂量可以局部应用于治疗持续性和顽固性铜绿假单胞菌感染。
关键词： 生物膜; 顺铂; 铜绿假单胞菌 ; 抵抗性; III型分泌物
铜绿假单胞菌是一种主要的医院病原体，其中包括角膜，慢性中耳炎，泌尿道（UTI）和呼吸道感染[1]。铜绿假单胞菌也是囊性纤维化（CF）[2]和癌症患者致命感染的主要原因[3,4]。铜绿假单胞菌作为主要病原体的成功归因于其形成弹性生物膜，抵抗抗微生物剂和分泌毒力产物的能力。
生物膜中的微生物细胞被细胞外基质包裹，保护它们免受抗菌治疗和宿主的免疫清除[5]。临床铜绿假单胞菌分离株主要是多药耐药（MDR）菌株[6]，具有强大的生物膜形成能力[7]。铜绿假单胞菌还分泌针对免疫系统重要组成部分的毒力因子，例如III型分泌系统（T3SS），其显示与下呼吸道感染[8]和呼吸机相关性肺炎患者的不良临床结果相关。[9]。鉴定在生物膜模式中主动靶向细菌的抗微生物化合物，包括削弱免疫防御的毒力机制，可以提供针对多种其他持久性铜绿假单胞菌感染的新型抗微生物疗法。
在这里，我们筛选了我们内部收集的FDA批准的药物，并发现顺铂是其他几种基于Pt（II）的化合物中最有效的杀死铜绿假单胞菌的药物。先前报道，顺铂对医院病原体具有抗菌作用，如大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌 [10]和持留细胞[11]。转录组学分析用于揭示顺铂如何抑制铜绿假单胞菌毒力因子的生长和产生的分子机制。我们还检查了顺铂治疗对体外铜绿假单胞菌的影响生物膜和角膜感染（角膜炎）的小鼠模型。我们发现顺铂比临床使用的抗生素妥布霉素在根除生物膜方面更有效。尽管顺铂对静脉内应用具有高毒性，但我们发现它在局部应用于伤口时毒性很低，因为25 mM（0.75 mg mL -1）对伤口愈合没有不良影响。这意味着更高剂量（5-10×MIC）的顺铂可以安全地用于局部应用。鉴于顺铂的局部毒性低，它可以用作预防和治疗铜绿假单胞菌生物膜感染的有吸引力的治疗剂。
细菌菌株和培养基
本研究中使用的细菌菌株列于支持信息文件1，表S3中。Luria-Bertani（LB）培养基用于维持细菌菌株。生长测定和静态生物膜培养在37℃下在ABTGC（ABT基本培养基[12]，补充0.4g / L葡萄糖和0.4g / L酪蛋白氨基酸）中进行。用于标记选择的铜绿假单胞菌，30微克毫升-1庆大霉素（GM），50微克毫升-1四环素（TC），100微克毫升-1链霉素（链球菌）或200微克毫升-1羧苄青霉素（CB）被使用，作为适当的。
用于MIC测定的铂络合物和溶液制剂
顺铂，transplatin，cDPCP，奥沙利铂，K 2氯铂酸4和顺 -PtCl 2（CH 3 CN）2购自Sigma-Aldrich购买被原样使用。铂络合物顺 -PtCl 2（PY）2 [13,14]和顺 -PtCl 2（PPH 3）2 [15]是根据所报告的方法制备。为最低抑菌浓度（MIC）测定法，顺铂，cDPCP，奥沙利铂，K 2氯铂酸4和顺 -PtCl 2（CH 3CN）2溶解在盐水溶液（0.85％重量/体积）在2.5mM的浓度，而transplatin，顺 -PtCl 2（PY）2和顺 -PtCl 2（PPH 3）2溶解在DMF（V / V）浓度为2.5 mM时。
最低抑菌浓度（MIC）的测定
使用如前所述的微量滴定肉汤稀释方法（≈1×10 5个细胞）在NACLAR指南中进行MIC测定[16]。。将细菌菌株的过夜培养物在ABTGC培养基中稀释。顺铂和其他含Pt化合物用ABTGC培养基从储备溶液中稀释，浓度比所需范围高10倍。将10μL每种稀释的Pt化合物溶液加入到96孔微量滴定板（聚丙烯，Costar）的每个相应孔中，并在连续稀释前加入在ABTGC培养基中的90μL稀释的细菌培养物。将板在37℃下孵育16-18小时。将MIC作为最低浓度，其中未检测到细菌的视觉生长（基于OD600）。实验一式三份进行，显示了代表性的结果。
RNA制备
使用先前描述的方法[17]收集细菌细胞并进行一些修改。通常，PAO1细胞用（1.5μM）或不用顺铂培养。在早期 - 静止期（培养约8小时后）收获细胞。用RNeasy Protect Bacteria Mini Kit（柱上DNA酶消化（Qiagen））提取总RNA。不含Turbo DNA的有力方案用于第二轮DNA酶处理（Ambion）。使用Ribo-Zero Magnetic Kit（细菌）（Epicenter）除去16S，23S和5S rRNA。
RNA测序和数据分析
通过Illumina RNA测序（RNA-Seq技术）进行基因表达分析。对每个样品的两个生物学重复进行RNA-Seq。将rRNA耗尽的RNA片段化为150-200bp片段，然后用cDNA合成试剂盒（ThermoScientific）合成第一和第二链cDNA，然后进行末端修复和衔接子连接。在12个PCR富集循环后，使用Bioanalyzer（Agilent Technologies，USA）评估文库的质量。使用具有配对末端方案的Illumina HiSeq 2500平台对文库进行测序，读取长度为100nt。
如前所述分析测序数据[12]。使用CLC基因组学工作台8.0（CLC Bio-Qiagen，Aarhus，Denmark）将序列读数定位到PAO1参考基因组上。中差异表达的基因通过使用DESeq执行负二项测试确定[18]的R包/ Bioconductor的[19] ，使用切断倍数变化大于2和BH（的Benjamini-Hochberg的）放大的调节P-值小于0.05。原始序列读数通过大小因子标准化，然后Log 2（N + 1）转化。使用转化的读数进行分层聚类分析，并使用热图[2] R的包来绘制顺铂处理的细胞和对照细胞之间的差异表达基因的热图。基于的功能富集分析进行PseudoCAP函数类（http://www.pseudomonas.com）和点图图是使用R的ggplot2 [20]包生成的。
RNA-Seq数据集可在NCBI序列阅读档案：SRS1038085和SRS1038089获得。
qRT-PCR分析
使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）提取总RNA，柱上DNA酶消化。通过NanoDrop分光光度法和Agilent 2200 TapeStation系统测定RNA的完整性，纯度和浓度。
使用两步法进行定量逆转录酶PCR（qRT-PCR）。使用SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix试剂盒（目录号18080-400，Invitrogen）从总RNA合成第一链cDNA。使用SYBR Select Master Mix试剂盒（目录号4472953，Applied Biosystems by Life Technologies），在具有特异性引物的Applied Biosystems StepOnePlus实时PCR系统中，将该cDNA用作qRT-PCR的模板（参见支持信息文件）。 1，表S4）。GAPDH，gyrB，rpoD的三个基因用作内源对照。使用熔解曲线分析来验证特定的单产物扩增。
铜绿假单胞菌杀灭试验
在OD 600 PAO1的过夜培养物，Δ 的recA和Δ 的recA测定互补株，并用0，3.125，分别6.25和12.5μM顺铂，调整至0.3 ABTGC平台。将菌株在37℃下以200rpm振荡温育4小时。然后收获培养物，连续稀释并涂布在LB琼脂平板上，在37℃下孵育过夜。计数平板上的菌落，并如下将菌落形成单位（CFU）mL -1制成表格：CFU mL -1=平均菌落数X稀释因子X用于在LB琼脂平板上铺展的体积。实验一式三份进行，结果显示为平均值±标准差
通过顺铂和妥布霉素进行铜绿假单胞菌生物膜杀伤试验
如前所述[21]，生物膜在24孔板（Nunc，Denmark）中于37℃生长。将生物膜用0.9％NaCl洗涤3次，并分别用含有0,3.125,6.25和12.5μM顺铂的ABTGC培养基处理。对于妥布霉素处理，生物膜分别用含有5.3,10.6和21.2μM妥布霉素的ABTGC培养基处理。将处理过的生物膜在37℃下孵育4小时。通过用细胞刮刀刮擦收获生物膜，在1mL 0.9％NaCl中匀浆，连续稀释并涂布在LB琼脂平板上，在37℃下孵育过夜。计数平板上的菌落并将CFU mL -1制成表格。实验一式三份进行，结果显示为平均值±标准差
RAW264.7巨噬细胞细胞毒性试验
将小鼠巨噬细胞（RAW264.7）维持在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies）中，补充有10％胎牛血清（FBS）（Gibco），在75cm 2细胞培养瓶中，密度为1.0× 在37℃，5％CO 2下，10 6个细胞mL -1，持续72小时。将每孔5.0×10 6个巨噬细胞接种在24孔板（Nunc，Denmark）中，并在37℃，5％CO 2下生长过夜。如前所述[12]，用PBS洗涤巨噬细胞一次，并用含有0,3.125,6.25和12.5μM顺铂的DMEM培养基中的PAO1以100个细菌细胞：1巨噬细胞的感染复数进行处理。作为对照，用T3SS缺陷Δ处理巨噬细胞pscJ突变体在DMEM培养基中。将共培养物在37℃，5％CO 2下孵育2小时。除去DMEM中的细胞外细菌细胞，用PBS洗涤感染的巨噬细胞3次。将新鲜的DMEM加入到感染的巨噬细胞中，然后在37℃，5％CO 2下进一步孵育巨噬细胞4小时。向巨噬细胞中加入含有20μM碘化丙啶（PI）的溶液，以染色用顺铂或ΔpscJ处理的PAO1杀死的死巨噬细胞。通过荧光显微镜（Zeiss，Germany）以200x对活的和死的巨噬细胞成像，并将其列为死亡巨噬细胞的％。实验一式三份进行，结果显示为平均值±标准差
兔角膜伤口愈合模型
从新加坡国立大学购买的新西兰白兔（n = 4，体重2至3kg）用于该研究。所有动物实验均遵照ARVO关于眼科和视觉研究中动物使用的声明，实验动物护理和使用指南（国家研究委员会）并在Singhealth实验医学中心（SEMC）的监督下进行。