嵌入β-桶蛋白中的烯烃复分解催化剂：产生用于烯烃复分解的人工金属蛋白

该综述总结了Grubbs-Hoveyda（GH）型烯烃复分解催化剂的最新进展，该催化剂结合到β-桶蛋白的稳健折叠中。讨论了锚定策略，并且从开环复分解聚合到体内烯烃复分解的简单小分子转化显示了该新兴领域中的挑战和机遇。

关键词： 人工金属蛋白; β-桶蛋白; metathease; 烯烃复分解; 钌

烯烃复分解构成在基于V，Mo，W，Re，Ru和Os的过渡金属催化剂以及烷基化助催化剂存在下C = C双键的重排。这种转化广泛用于有机合成以及各种不饱和单体的聚合[1]。根据Chauvin机理，催化活性物质是Schrock型卡宾或亚烷基[2]。烯烃复分解从结构上明确定义的金属亚烷基配合物的分离中获益匪浅[3,4]。研究最多且最常用的催化剂基于Mo，W和Ru [1]。

最初，这些复合物被认为对空气和水分敏感。然而，将Ru，Os和Ir盐加入到降冰片烯衍生物的水溶液或乳液中导致开环易位聚合，得到相应的聚合物[5,6]。通过在所谓的Grubbs第一代催化剂中加入N-杂环卡宾（NHC）配体和螯合苯乙烯来改进第一配位球，相对空气和水分稳定的Grubbs-Hoveyda型（GH型）催化剂得到了[7]。这些催化剂不仅表现出对水分的稳定性，而且还可以直接用于水中，允许在水溶液中进行烯烃复分解反应[8,9]。

烯烃复分解在生物系统中是未知的，因此可以被认为是生物正交的。戴维斯小组利用烯烃复分解反应进行表达后蛋白质修饰[10-12]。例如，来自Bacilus lentus（SBL-S156C）的枯草杆菌蛋白酶的单个半胱氨酸突变体通过形成硫化物键而被修饰，其中烯丙基半胱氨酸在蛋白质表面上显示出烯丙基功能。该烯丙基用GH型催化剂进行改性，并附着碳水化合物或小聚乙二醇（PEG）基团[11]。作为用烯烃复分解修饰蛋白质表面的另一种策略，Isarov和Pokorski在溶菌酶表面引入了Grubbs第3代催化剂，并在聚乙二醇化降冰片烯衍生物作为底物的蛋白质表面上进行了开环易位聚合（ROMP）[13]。。这导致用PEG链修饰的蛋白质。这两个实施例说明了烯烃复分解在蛋白质修饰中的潜在应用。进一步的应用是将烯烃复分解反应转化为天然代谢途径，以合成精细化学品[14]。而且，在活细胞内的特定环境中的靶向反应具有催化剂的精确释放或活化，将能够实现新的药物递送方式。克服这一问题的挑战是细胞内催化剂的失活和生物体内的转运，而不会触发或激活相应靶标的反应[15]。另外，为此目的，需要改进催化剂在水溶液中的（动力学）稳定性。对于水性环境中有机合成的应用，水溶性也是必不可少的[16-18]。

一种有前景的方法是将GH型催化剂嵌入明确定义的蛋白质支架中[19]。工程蛋白与合成金属催化剂的组合产生人工金属蛋白[20-23]。在复分解催化剂的情况下，获得所谓的人造复分解酶，其可以开辟生物应用的新领域[19]。作为第二配位球的蛋白质可能会影响最初由Chauvin [2]假设的金属环丁烷的形成。E或Z产物的形成取决于催化循环的该步骤中R基团的取向（方案1）。

人工复分解酶 - 锚定方法

在蛋白质中含有一种或多种金属离子（如Mg，Ca，Mn，Fe，Ni，Co，Cu，Zn等）的金属蛋白质性质丰富[24]。作为金属酶，这些金属蛋白能够催化生物合成中的各种重要反应和细胞能量代谢中的关键步骤。嵌入的金属离子主要用作路易斯酸催化剂或氧化还原催化剂。各种金属酶已经应用于实验室规模的反应中，并且一些金属酶如腈水合酶（活性位点中的钴（III））用于生产丙烯酰胺已经在工业中得到应用[25]。。然而，值得注意的是，天然酶的反应范围非常有限。除了工程化天然酶之外，将非生物辅因子（如有机金属配合物）与天然或重新设计的蛋白质支架连接的方法提供了两者的有吸引力的组合，化学转化的广泛反应范围以及选择性和特异性的控制。在天然酶中发现。这些所谓的人工金属蛋白或金属酶提供了两种微调活性和选择性的方法：作为化学方法，可以通过修饰金属周围的配体来调节和微调金属位点。作为生物技术手段，可以优化作为第二配位球的蛋白质腔，以调节特异性以及立体和区域选择性。[20-22]。

在构建人工金属蛋白质时要克服的挑战之一是找到一种将合成金属配合物掺入蛋白质支架中的方法[26]。常见的策略如图1所示。

在图1中，显示了三种常用的掺入合成辅助因子的方法。使用的策略是超分子，配价和共价锚定。超分子锚定是由Wilson和Whitesides在1978年开创的[27]。他们利用（链霉）抗生物素蛋白（SAV）的高亲和力的生物素，它表示在自然界中发现具有的解离常数的最强超分子相互作用的一个大约ķ d ≈10 -15中号[28] 。最初，连接非手性Wilkinson型催化剂进行氢化[27]。如今，已经建立了基于该技术的多种人工金属蛋白[20,29]。与超分子锚定相比，Dative锚定提供了从蛋白质中释放活性位点的可能性。然而，能够进行配位锚定的催化剂的设计通常基于抑制剂与蛋白质活性位点的相互作用。这使得催化剂设计具有挑战性并且应用受到限制。有机金属配合物的共价锚定提供了催化剂在蛋白质支架内的精确定位。在辅因子和蛋白质之间形成共价键确保了活性位点（即金属络合物）的不可逆结合。该方法是高度通用的，因为不必具有或设计非共价锚定所需的相互作用，例如超分子或定向锚定。

所有三个锚固方法-超分子，配价键和共价-已被用于构建能够催化烯烃复分解反应的人工金属蛋白[19] 。迄今为止，已报道了8种人造复分解酶。其中，β-桶蛋白作为蛋白质支架起着重要作用。

β-桶蛋白

蛋白质由两个主要的二级结构元件构成，即α-螺旋和β-折叠。值得注意的是，后者通常被认为比无序或α-螺旋结构更具刚性[30,31]。β-桶是在许多蛋白质中发现的结构基序，其中（大多数）反平行的β-链扭曲和卷曲形成由氢键网络连接在一起的封闭的准圆柱形结构[32]。具有两亲性质，具有疏水“桶”内部和亲水表面（如球蛋白，疏水分子和荧光蛋白的载体）或亲水核和疏水表面（如膜结合β-桶，如孔蛋白和通道蛋白），它们可以作为次要基序存在，甚至可以控制整体蛋白质结构[33,34]。

脂质运载蛋白的小β-桶（即在许多生物过程中起重要作用的小疏水分子的转运蛋白[35]）或全β-桶型的含血红素的硝基荧光素/硝基吲哚类（参与NO运输，储存和感知以及血红素代谢[36]）通常构成8到10个反平行β-链和紧密包装的疏水或亲水桶内部[37]。膜结合β-桶仅限于线粒体和叶绿体膜以及革兰氏阴性菌的外膜[38]。它们构成多达24股，需要复杂的装配机械进行膜整合[39]并且通常由亲水环和螺旋“堵塞”，所述亲水环和螺旋确保小分子的结合，或它们（能量依赖性）跨外膜的转运。TIM桶（以磷酸丙糖异构酶命名，TIM）反过来包含α-和β-结构，即由一系列8个α-螺旋包围的β-桶结构（8个链）。TIM-barrel代表了一种非常常见但又具有进化多样性的蛋白质结构[40]。

在遵循非常相似的结构模式的同时，β-桶和TIM桶蛋白占据巨大的序列空间，并且在代谢功能，结合特性，转运和催化活性方面具有高度通用性。紧凑的桶状结构可被视为稳定蛋白质支架/基序的原型，其表现出对多种外部影响的稳定性，包括高盐浓度，高温和有机溶剂[41-45]。这些性质使它们成为构建人造金属酶的优异支架，这通过去除天然辅助因子或软木/塞子结构域以显示可以随后装载人造催化剂的其他占据的口袋或孔来实现。

β-桶蛋白内的人工复分解酶

（链霉）抗生物素蛋白

Ward [29]合成了基于超分子锚定方法的烯烃复分解的人工金属蛋白。GH型第二代烯烃复分解催化剂在NHC配体的外围被生物素部分修饰[46]。将小β-桶蛋白抗生物素蛋白（Avi）或链霉抗生物素蛋白（Sav）与催化剂一起温育，得到人造金属蛋白。该（链霉）基于抗生物素蛋白的催化剂在N，N-二烯丙基-4-甲苯磺酰胺（1）在水性缓冲溶液中的RCM反应中进行测试[46]。实现了Avi作为蛋白质支架的转化率高达95％（催化剂载量为5mol％）。这是描述在蛋白质腔内进行的烯烃复分解的第一个实例。在这项研究中，已经明确了间隔物长度的重要性。GH型催化剂（Ru-1）和生物素部分之间的短间隔物不会导致底物的成功转化。间隔物（Ru-2）的伸长并因此将活性位点略微移出蛋白质腔导致改善的转化。