Niemann-Pick C型（NPC）疾病，其特征在于由于两种蛋白质NPC1和NPC2的缺陷而导致的未酯化胆固醇和其他脂质的细胞内积累，引起神经变性和其他致命的神经病变症状。目前，NPC的治疗涉及使用2-羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）。HP-β-CD在治疗NPC疾病中的肝脾肿大方面是有效的，尽管剂量非常高。减少用于治疗NPC的所需HP-β-CD剂量的方法之一是用β-环糊精（β-CD）主动靶向肝细胞。本研究的目的是合成一种新的多乳糖附加β-CD（多Lac-β-CD）并评估其在U18666A处理的HepG2（NPC样HepG2）细胞中的降胆固醇作用。进一步，该研究旨在通过胆固醇积累的HepG2细胞将β-CD传递给肝细胞，并表明新合成的多Lac-β-CD的平均乳糖替代度（DSL）为5.6。与HP-β-CD相比，发现这种新合成的多Lac-β-CD显着降低细胞内胆固醇浓度，而细胞毒性可忽略不计。在NPC样HepG2细胞中观察到TRITC-multi-Lac-β-CD（DSL 5.6）与TRITC-HP-β-CD相比增加的内化。此外，发现花生凝集素与多Lac-β-CD（DSL5.6）的解离常数极低（2.5×10）与HP-β-CD相比，发现这种新合成的多Lac-β-CD显着降低细胞内胆固醇浓度，而细胞毒性可忽略不计。在NPC样HepG2细胞中观察到TRITC-multi-Lac-β-CD（DSL 5.6）与TRITC-HP-β-CD相比增加的内化。此外，发现花生凝集素与多Lac-β-CD（DSL5.6）的解离常数极低（2.5×10）与HP-β-CD相比，发现这种新合成的多Lac-β-CD显着降低细胞内胆固醇浓度，而细胞毒性可忽略不计。在NPC样HepG2细胞中观察到TRITC-multi-Lac-β-CD（DSL 5.6）与TRITC-HP-β-CD相比增加的内化。此外，发现花生凝集素与多Lac-β-CD（DSL5.6）的解离常数极低（2.5×10）-8 M）。这些结果表明，多Lac-β-CD（DSL5.6）通过脱唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）介导的内吞作用降低了NPC样HepG2细胞中的细胞内胆固醇水平。
关键词： 脱唾液酸糖蛋白受体; 胆固醇; 环糊精; 乳糖; Niemann-Pick C型疾病
Niemann-Pick C型（NPC）疾病是一种脂质储存疾病，具有膜脂质如胆固醇和多种鞘脂的积累，尤其是在溶酶体中。这些脂质的过度积累导致进行性神经和内脏功能障碍[1-3]。NPC1和/或NPC2基因中的突变引起NPC疾病。大多数突变发生在NPC1基因中，该基因产生NPC1蛋白，负责结合[3]并将胆固醇转运至内溶酶体[4,5]。同时剩余的突变位于NPC2中编码NPC2蛋白作为溶酶体蛋白的基因。儿童内溶素体中过多的胆固醇积聚导致严重的肝脾肿大和神经变性[3,6]。因此，胆固醇的隔离是NPC疾病发展的重要因素。
环糊精（CD）是制药工业用于增强药物的溶解性，稳定性和生物利用度的环状葡萄糖寡糖。当配制成可注射溶液，喷雾剂，滴眼剂，粉末和片剂时，CD通过复合物形成改善了药物的上述性质[7,8]。近年来，2-羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）治疗鼻咽癌的疗效引起了人们的广泛关注[9,10]。向NPC1敲除（Npc1 - / -）小鼠施用HP-β-CD 通过降低胆固醇水平显着延长了存活率[9-11]。此外，已经在NPC疾病的小鼠模型中观察到HP-β-CD的治疗效果。这些研究已导致美国国立卫生研究院（NIH）启动了两项人体临床试验，即2013年的I / IIa期试验和2015年的IIb / III期试验。然而，高剂量HP-β-CD的施用不可避免地在体内获得效果，因为HP-β-CD由于其亲水性和相对高的分子量而不能进入细胞。
脱唾液酸糖蛋白受体（ASGPR），一种肝半乳糖或N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）受体，在肝细胞的窦状细胞表面高度表达。ASGPR负责结合，内化和随后清除含有来自循环的末端半乳糖或GlcNAc残基的糖蛋白[12]。因此，半乳糖基化的纳米载体已被用于通过ASGPR介导的内吞作用将药物选择性递送至肝脏[13]。事实上，ASGPR介导的内吞作用是将CD递送到肝细胞中用于治疗NPC疾病中的肝脾肿大的有前途的方法之一。在我们之前的报告中，单乳糖基化的β-CD（mono-Lac-β-CD）减少了U18666A处理的HepG2细胞（NPC样HepG2细胞）中的胆固醇积累，作为NPC肝细胞的模型，与HP-β一样多。 CD [14]。此外，ASGPR在三个点识别半乳糖部分，统称为“金三角” [15,16]。然而，由于单-Lac-β-CD只能与ASGPR的金三角中的一个点结合，因此它与ASGPR的结合能力不足。
因此，在本研究中，我们合成了一种新的多乳糖附加β-CD（多Lac-β-CD）以增强对ASGPR的靶向能力，并评估其在NPC样HepG2细胞中的降胆固醇作用。
多Lac-β-CD的合成
在本研究中，我们制备了多种Lac-β-CD（5）以获得肝细胞特异性降胆固醇剂。多Lac-β-CD（5）合成的示意图如图1所示。简单地说，每 -NH 2 -β-CD（4）由合成氯化（每氯-β-CD（2））和叠氮化（每叠氮-β-CD（3））β-的伯羟基的CD 1，如前所述[17]。有可能使用per -iodo-或per - bromo -β-CD而不是per氯-β-CD。然而，由于反应性太高，碘-β-CD可能不稳定。因此，我们制备了具有足够反应性的per -chloro-β-CD。最后，通过用二氢亚砜（DMSO）中的氰基三氢硼酸盐在90℃下处理24小时，将乳糖基团插入到per -amino-β-CD中。多Lac-β-CD的产物收率为25％，并且未通过薄层色谱（TLC）确认未反应的化合物。多紫胶-β-CD的MALDI-TOF MS谱揭示了几个峰在米 / Ž 2804 米 / Ž 3006 米 / Ž 3139，米 / Ž 3296 ，和米 /z 3454，分别对应于三 - ，四 - ，五 - ，六 - 和七 - 乳糖 - 取代的β-CD（图2A）。此外，1 H NMR谱表明乳糖（DSL）的取代度为5.6。该值是从β-CD中乳糖和葡萄糖的端基质子的积分值获得的（图2B）。这些结果表明多种Lac-β-CD（DSL5.6）的成功合成。