双环核酸的合成与生物物理特性和分子动力学模拟

在这里，我们报告了含有不饱和6'-氟[4.3.0]双环核苷酸（6'F-bc 4,3 - DNA）的寡核苷酸的合成，生物物理特性和分子模拟。从先前描述的[3.3.0]双环糖开始合成两个6'F-bc 4,3亚磷酰胺结构单元（T和C）。通过二氟卡宾添加将该糖转化为宝石 - 二氟三环中间体，然后通过NIS介导的或Vorbrüggen核苷酸化，在两种情况下产生β-三环核苷作为主要异头物。随后这些三环中间体的脱硅烷基化和环丙烷开环得到不饱和的6'F-bc 4,3核苷。用叔丁基氢过氧化物作为氧化剂将相应的亚磷酰胺结构单元成功掺入寡核苷酸中。经修饰的双链体的热解链实验公开对DNA和RNA互补去稳定作用，但具有更小的程度失稳与互补DNA（Δ的Ť 米 / MOD = -1.5至-3.7℃）。核苷和寡核苷酸水平的分子动力学模拟揭示了呋喃糖环的C1'- 外切 / C2'- 内切比对的偏好。此外，具有互补RNA的双链体的模拟公开了DNA / RNA型双链体结构，表明该修饰可能是RNase H的底物。

关键词： DNA / RNA亲和力; 氟化环丙烷; 氟化核酸; 分子动力学模拟; 糖修饰的核苷

用于治疗各种疾病如癌症，病毒和遗传疾病的有效策略是使用治疗性反义寡核苷酸（AON）[1-4]。这些短的合成片段通过Watson-Crick碱基配对与细胞RNA结合，从而通过各种机制调节或沉默基因表达[5-7]。一种作用方式是内切核酸酶RNA酶H1的募集，其选择性地切割DNA / RNA杂交双链体的RNA链[8]。为了激活这个过程，使用完全修饰的DNA样寡核苷酸（ONs）或gapmer AONs [9,10]。然而，基于寡核苷酸的治疗剂的广泛使用受到若干因素的限制，其中细胞递送，生物稳定性，对靶RNA序列的亲和力和特异性是至关重要的[11]。增加互补RNA亲和力和提高ON生物稳定性的有效策略是通过额外的环系统和桥构成柔性骨架的构象限制[12]。这类构象限制核酸的突出成员是锁定核酸（LNAs）[ 13-15]，己糖醇核酸（HNAs）[16,17]，环己烯基核酸（CeNAs）[18,19]，三环DNA （tc-DNAs，图1）[20-22]和[4.3.0]双环-DNAs （bc 4,3 -DNAs ，图1）[23]。

克服一些限制的另一种策略涉及在核酸类似物的糖部分中插入一个或几个氟原子。氟原子的极性疏水性[24]可以积极地改变修饰核苷酸的呋喃糖构象，碱性和/或极化性，因此影响AON的代谢稳定性，膜渗透性，RNA-和蛋白质结合亲和力。[25-29]。在过去的近二十年中，氟化寡核苷酸类似物如2'-脱氧-2'-氟代RNA（F-RNA）[26,30,31]，2'-脱氧-2'-氟阿拉伯糖核酸（F-ANA） ）[32-34]，3'-己糖醇核酸（FHNA和Ara-FHNA）[35]评估了2'-氟代环己烯基核酸（F-CeNA）[36]和其他修饰[37-41]的反义特性。在此背景下，我们的研究小组系统地分析了氟原子对bc-DNA和tc-DNA支架的影响。[3.3.0]双环-DNA的6'-β-氟化导致氟原子与胸腺嘧啶碱基的C（6）氢原子之间的假氢键相互作用，固定扭转角χ。因此，观察到对互补RNA靶标的亲和力增加[42]。在tc-DNA的情况下，C（6'）氟化作用与标准tc-DNA产生与RNA相似的亲和力，表明没有贡献的氟假氢键如bc-DNA [43]。在完全修饰的2'F-tc-ANA序列中也观察到与非氟化tc-DNA相似的对互补DNA或RNA的亲和力[44]。相反，由于呋喃糖构象的构象控制，RNA靶标的显着稳定导致2'F-tc-RNA修饰的情况[45]。为了进一步扩大氟化核酸类似物作为治疗性寡核苷酸构建模块的范围，我们研究了bc 4,3-DNA作为修饰的支架。想法是将氟原子置于核苷间键的旁边。此外，预计环己烷环中的另外的双键会使碳环单元硬化并可能对双链体稳定性产生积极影响。在这里，我们报告了两个6'F-bc 4,3嘧啶类似物与基础T和C 的合成，它们与DNA的结合，它们的生物物理特性，以及通过分子动力学模拟杂交DNA和RNA的结构分析。双链。

亚磷酰胺结构单元的合成

我们构建两个亚磷酰胺结构单元10和16的策略被设想为通过选择性环丙烷开环通过环增大从三环硅氧基二环丙烷形成[4.3.0]双环氟烯酮的关键步骤[46-49]。因此，合成从先前描述的双环甲硅烷基烯醇醚1α / β开始（方案1）[50,51]。通过调整和改进已有的方案[50]，将1的两个异构体分别转化为三甲基甲硅烷基（TMS）保护的糖2α / β。。然后用Ruppert-Prakash试剂（TMSCF 3）作为二氟卡宾前体和碘化钠作为引发剂单独处理糖2α / β [52]，得到外 - 三环糖3α / β作为主要异构体。对该反应的更接近的评价表明，甲硅烷基烯醇醚的类型极大地影响了相应的硅氧基二氟环丙烷的产率。而TMS烯醇醚不适合的反应由于甲硅烷基的不稳定性，所述叔 - 二丁基甲硅烷基（TBDMS）烯醇醚的反应性很差，很可能是由于二氟卡宾对双键的攻击阻碍。环丙烷环周围的立体化学（endo vs exo）可以通过相应的1 H和13 C NMR光谱中氟原子与内 - 三环糖中的HC（1）或C（7）之间的特征耦合模式来评估。（支持信息文件1）。