嗜热磷酸核糖基转移酶Thermus thermophilus HB27在核苷酸合成中

磷酸核糖基转移酶是允许使用多酶级联合成核苷酸类似物的工具。来自嗜热栖热菌 HB27 的重组腺嘌呤磷酸核糖转移酶（Tth APRT）和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（Tth HPRT）在大肠杆菌菌株中表达，并通过色谱法纯化，产量为每升培养物10-13mg。研究了Tth APRT和Tth HPRT对不同因子的活性依赖性以及对不同杂环碱的底物特异性。Tth的动力学参数测定了具有天然底物的HPRT。合成了两个核苷酸：9-（β-D-呋喃核糖基）-2-氯腺嘌呤5'-单磷酸（2-Сl-AMP），使用Tth APRT和1-（β-D-呋喃核糖基）吡唑并[3,4- d ]嘧啶-4-酮使用5'-单磷酸（Allop-MP）Tth时 НPRT。

关键词： 腺嘌呤磷酸核糖转移酶; 催化; 酶; 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶; 多酶级联反应; 核苷酸; 嗜热

细菌磷酸核糖转移酶用于多酶级联反应，从头进行核苷酸合成[1,2]。最近，我们报道了级联合成的可能性，其中嗜热微生物Thermus thermophilus HB27（磷酸核糖焦磷酸合成酶-PRPPS和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶-APRT）和Thermus sp。2.9（核糖激酶-RK）将核糖和腺嘌呤杂环碱基连续转化为相应的核苷酸（图1）。嗜热磷酸核糖基转移酶的使用允许在更高温度下进行反应，因此可以增加杂环碱的浓度[1-3]。

由于酶[4,10,11]的区域和立体特异性，进行基质的代谢转化，因此开发用于制备核苷和核苷酸的多酶级联反应[4-9]非常令人感兴趣。磷酸核糖基转移酶越来越多地被广泛用作多酶系统中的关键酶[2]。APRT的底物特异性限制了可合成的可能核苷酸的数量。因此，对于嗜热栖热菌 HB27 APRT（Tth APRT ），核苷酸合成仅限于最接近的腺嘌呤结构同源物（表1）[1]。

一个反应混合物（0.5毫升，20毫摩尔的Tris-HCl，pH 8.0中，75℃）含有0.4毫杂环碱基，0.4mM的PRPP，0-5毫摩尔MgCl 2，1.25微克Tth时 APRT [1] 。

不幸的是，1,2,4-三唑-3-甲酰胺，其类似物，鸟嘌呤，次黄嘌呤和7-脱氮尿嘧啶不是Tth APRT的底物。这严重限制了多酶级联在核苷酸合成中的可用性，包括修饰的核苷酸。

为了扩展可能合成的可能的核苷酸库，我们获得了重组形式的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶Thermus thermophilus（Tth HPRT），研究了其底物特异性和催化活性的最佳条件，并确定了酶的动力学参数。进行TthAPRT和Tth HPRT 的底物特异性的比较研究以确定嗜热转移酶在核苷酸合成中的可用性。使用Tth APRT和TthHPRT 的嘌呤核苷酸合成方案显示在图2中。

将来自嗜热链球菌HB27的编码Tth HPRT和Tth APRT的基因TT_RS08985和TT_RS06315 分别克隆到表达质粒载体pET 23a +和pET 23d +中。得到的重组质粒pER- Tth HPRT含有编码Tth HPRT的融合基因HPRT-HisTag ，其具有C末端His-Tag。得到的重组质粒pER- Tth APRT 含有编码Tth APRT 的基因APRT，没有任何其他序列。通过测序验证克隆基因的核苷酸序列。在编码Tth HPRT 的基因中发现了对应于氨基酸Arg27Gly置换的密码子GGG→AGG取代。

进行可用生产菌株的筛选以发现菌株，其产生可溶形式的靶酶。得到的菌株大肠杆菌 BL21（DE3）/ pER- TthAPRT 和大肠杆菌 C3030 / pER- Tth HPRT产生主要以可溶形式（> 80％）的酶。

用于分离和纯化Tth HPRT 的既定程序包括热处理，固定化金属亲和层析，最终尺寸排阻层析和浓缩。对于TthAPRT，该方案包括热处理，阴离子交换色谱，疏水色谱，最终尺寸排阻色谱和浓缩。两种转移酶的产量均不低于10-13mg /升培养物，纯度为约96％（通过SDS-PAGE测定）。

研究了温度和Mg 2+浓度对Tth HPRT 活性的影响。将结果与先前获得的腺嘌呤磷酸核糖转移酶Thermus thermophilus的数据进行比较[1]。

的Tth时 APRT是在宽的温度范围内（有源图3）。在60℃下观察到Tth HPRT的最大活性（1.1单位/ mg）。36°C时的活性是最大值的5％，90°时的活性是最大值的3％。有趣的是，Tth APRT在75°C时显示出其最大活性。