通过Hirao反应合成新的2-或4-膦酸化的13α-雌酮衍生物。使用Pd（PPh 3）4使13α-雌酮及其3-苄基或3-甲基醚的溴代区域异构体（2-或4-）与亚磷酸二乙酯或二苯基膦氧化物反应作为微波辐射下的催化剂。通过测量级联蓝吸收来研究新化合物对有机阴离子转运多肽OATP2B1的转运功能的影响。具有3-苄基醚功能的衍生物显示出显着的亚微摩尔OATP2B1抑制活性。通过体外放射性底物培养方法研究了化合物对人胎盘类固醇硫酸酯酶（STS）和17β-羟基类固醇脱氢酶1型同工酶（17β-HSD1）的抑制作用。没有一种试验化合物显着抑制STS。结构 - 活性关系评估显示2-取代的3-羟基衍生物能够以亚微摩尔IC 50值抑制17β-HSD1酶。已鉴定出双OATP2B1和17β-HSD1抑制剂。
关键词： 催化; 酶; 13α -雌酮; 平尾反应; 17β-HSD1抑制; OATP2B1; STS
雌激素的生物合成通过各种酶促途径发生。细胞色素P450芳香酶催化非芳香族类固醇转化为雌激素[1]。此外，作为由类固醇硫酸酯酶（STS）催化的大型循环储库存在的雌酮3-硫酸盐的水解是用于局部供应雌激素的前激素雌酮的主要替代来源之一[2]。。细胞水平上游离雌酮的可用性取决于STS和/或SULT的表达，其催化酚羟基官能团的硫酸化。另一方面，硫酸雌酮不能被动地穿过细胞膜; 因此，需要载体来介导其跨脂质双层的转运。这些载体是溶质载体超家族（SLC）的某些代表，包括有机阴离子转运多肽（OATP）蛋白家族的成员[3,4]。人OATP2B1是运输3-硫酸雌酮的OATP之一，在肠，血脑屏障，肝脏和胎盘中表达[5-9]。此外，OATP2B1在某些恶性肿瘤中过度表达，包括乳腺癌[10]。OATP2B1以钠和ATP非依赖性方式转运其底物，包括硫酸雌酮[11,12]。进入细胞后，雌酮-3-硫酸盐进行涉及不同胞质酶的酶促转化。由STS催化的脱硫作用之后是17-氧代功能的立体特异性还原，导致17β-雌二醇。雌激素生物合成的最后一步是由17β-羟基类固醇脱氢酶1型同工酶（17β-HSD1）催化[13]。因此，STS和17β-HSD1成为雌激素依赖性疾病的重要药物靶点[1,14]。它们的抑制可能是抑制局部雌激素生成的有力策略。此外，通过抑制OATP将雌酮 - 硫酸盐进入细胞可能是一个很好的选择[15,16]。先前抑制参与雌二醇生物合成的胞质酶，可以阻断共轭雌酮衍生物（包括雌酮-3-硫酸酯）的转运。基于雌甾烯核心的抑制剂可具有关于硫酸酯酶途径的两个酶促步骤和OATP2B1介导的雌酮 - 硫酸盐的膜转运的多种抑制性质。
抑制剂设计通常基于靶蛋白的底物。文献揭示了多种合成雌酮衍生物如STS或17β-HSD1抑制剂[1,14]，但据我们所知，目前还没有关于基于雌酮的OATP2B1抑制剂的报道。请注意，雌酮本身已被证明可略微抑制OATP2B1对雌酮-3-硫酸盐的摄取[6]。甾体STS或17β-HSD1抑制剂均未达到临床试验，这主要是由于它们保留了雌激素活性。这种副作用可以通过基于天然雌酮13-差向异构体（13α-雌酮，13αE1OH）的抑制剂设计来消除[17,18]。Poirier等人。证明3,17-雌二醇的13α-衍生物对雌激素受体α的结合亲和力降低，并且没有显示出子宫内膜活性[19]。由C-13的倒位引起的构象变化导致差向异构体不能与其核受体结合。我们最近已经确定13α-雌酮，不论其显着的结构变化，对17β-HSD1显示出与天然底物雌酮相似的亲和力[20]。这一发现使我们设计出基于激素失活的13α-雌蕊核心的新型17β-HSD1抑制剂。转化13α-雌酮的环A以获得2-取代的衍生物[21-23]。根据17β-HSD1与17β-雌二醇复合物的晶体结构，Möller等。描述，在类固醇的C-2原子附近有一个未被占据的亲脂性隧道[24]。他们改善天然雌酮衍生物抑制活性的策略是在雌酮的C-2上引入大的卤素和苯乙炔基或苯乙基官能团。它们最有效的化合物显示出纳摩尔抑制活性。我们之前的相关工作包括合成和体外17β-HSD1测定激素失活的13α-estrane核的相似衍生物[21-23]。我们发现，与大卤素（Br或I）的2-和/或4-取代导致亚微摩尔抑制剂，而与引入的卤素的位置和数量无关。在苯乙炔基或苯乙基-13α-雌酮的情况下，只有2-区域异构体显示出显着的抑制作用，这不依赖于与C-2连接的碳的杂化状态[22]。潘等人。描述了雌酮环A的卤化是合成有效STS抑制剂的有力策略[25]。某些4-卤代雌酮衍生物对酶的亲和力高于其母体化合物雌酮。基于这些发现，我们也测试了针对STS的卤代13α-雌酮衍生物[23]。引入的卤素的性质和位置都显着影响STS抑制潜力。证明在4-碘和2,4-二碘代化合物中存在大的取代基是有利的，因为这些化合物用IC 50抑制酶。低微摩尔范围内的值。可以说，在13α-雌酮的C-2或C-4上引入大的亲脂基团可以分别改善它们对17β-HSD1和STS的亲和力。为了获得关于引入的官能团的性质和位置对抑制活性的影响的更多结构活性数据，新的环A取代的13α-雌酮衍生物的合成和测试将是特别令人感兴趣的。考虑到OATP2B1在某些人类恶性肿瘤中表达并且它有效地转运雌酮-3-硫酸盐，因此设计，合成和研究针对该转运蛋白的潜在的13α-雌酮抑制剂也是值得的。环A取代基位置不同，预计大小和极性对靶蛋白的亲和力具有显着影响。研究直接附着在13α-雌酮的芳环A上的原子的性质和引入的部分的立体化学的影响也是高度关注的。
在这里，我们公开了新的2-或合成4-取代的13α -雌酮衍生物8 - 13经由平尾反应（方案1）。选择亚磷酸二乙酯（7a）或二苯基氧化膦（7b）作为> P（O）H试剂，并且使用基于Pd的催化在微波辐射下计划C-P偶联。的新合成的化合物的抑制活性调查8 - 13靠在OATP2B1转运蛋白和17β-HSD1或STS胞质酶还旨在。
Hirao反应是使用二烷基亚磷酸酯（H-膦酸酯）作为试剂，Pd（PPh 3）4作为催化剂和Et 3 N作为碱[26]，由芳基溴化物或碘化物合成芳基膦酸酯的有力工具。最近发表了反应的变化以制备多种官能化膦酸盐[27,28]。C-P联轴器不仅在传统的热条件下进行，而且微波辐射的重要优点也被用于该领域[29]。
使用2-溴 - 或碘 - 13α-雌酮3-甲基醚（1或1I）作为起始化合物和亚磷酸二乙酯（7a）作为试剂进行反应条件的优化（表1，方案1）。使用两种Pd源，即Pd（PPh 3）4或Pd（OAc）2，后者不添加任何单 - 或二齿P-配体。尽管通常可成功使用Et 3 N，但可能发生亚磷酸酯试剂的脱烷基化。为了避免这种不希望的副反应，K 2 CO 3也参与了优化。乙腈作为溶剂的选择基于文献数据[27-29]。乙腈是Hirao反应中使用最广泛的溶剂之一。在微波辐射下进行偶联。根据文献资料选择亚磷酸二乙酯的量[29] ; 即，当使用Pd（OAc）2时，在Pd（PPh 3）4和1.3当量的情况下为1当量。早先已经确定，在微波辅助Pd（II）催化的芳基溴化物和亚磷酸二烷基酯的C-P偶联中，过量的所用二烷基亚磷酸酯可以作为磷配体和还原剂[29]。