开发具有双重靶向性的新型环状NGR肽 - 道诺霉素结合物

作为归巢装置的环状NGR肽是开发用于靶向肿瘤治疗的药物缀合物的良好候选者。在我们之前的研究中，我们报道了Dau = Aoa-GFLGK（c [KNGRE] -GG - ） - NH 2缀合物对CD13 + HT-1080人纤维肉瘤和CD13-但整联蛋白阳性HT-29人结肠腺癌细胞具有显着的抗肿瘤活性。然而，似乎循环中赖氨酸的游离ε-氨基对于生物活性不是必需的。因此，我们开发了新的环状NGR肽 - 道诺霉素缀合物，其中Lys被不同的氨基酸（Ala，Leu，Nle，Pro，Ser）取代。在循环中交换Lys残基简化了环化步骤并导致更高的产率。与对照化合物相比，新的缀合物对Asn脱酰胺的化学稳定性较低，因此它们对CD13 +细胞的选择性较低。然而，Dau = Aoa-GFLGK（c [NleNGRE] -GG - ） - NH 2的细胞摄取和细胞毒作用与对照相比，特别是在HT-29细胞上更高。因此，该缀合物更适合具有双重靶向性质的药物靶向。

关键词： 抗肿瘤活性; 药物释放; NGR肽; 肟键; 靶向给药

靶向化疗是选择性癌症治疗最有希望的方法之一，可以减少抗癌药物的毒副作用。该治疗方法基于肿瘤特异性受体在癌细胞/组织上高度表达的事实。通过噬菌体展示鉴定的含有NGR（Asn-Gly-Arg）基序的肽是选择性药物递送的合适候选者。NGR肽与肿瘤细胞和肿瘤相关血管生成血管上的CD13受体结合[1,2]。CD13是一种跨膜锌依赖性金属蛋白酶，在细胞增殖，细胞迁移和血管生成中发挥作用[1,3,4]。然而，已知Asn-Gly部分通过琥珀酰亚胺形成进行Asn脱酰胺，导致异天冬氨酸（isoAsp，isoD）和天冬氨酸衍生物在水解后通常以3：1的比例[5-11]。IsoDGR肽以高亲和力与RGD-整联蛋白受体结合[12-14]。由于它们在肿瘤增殖，转移和血管生成中的功能，整联蛋白受体也是癌症治疗的有希望的靶标。因此，NGR-肽归巢装置可以提供抗癌药物的双重靶向递送。

根据文献资料，最稳定和肿瘤选择性的环状NGR-肽之一是c [KNGRE] -NH 2，其中N-末端Lys 的α-氨基与γ-羧基偶联。谷氨酸残基（头对侧链循环）。俄勒冈绿（OG）标记的c [KNGRE] -NH 2（附着于Lys侧链的OG）的体外荧光显微镜研究显示选择性结合CD13-受体阳性（CD13 +）HT-1080人纤维肉瘤细胞和最小结合对受体阴性（CD13-）MCF-7人乳腺癌细胞[15]。此外，68 Ga-放射性示踪剂标记了环[KNGRE] -NH 2的衍生物已成功用于PET的肿瘤诊断研究，表明其与表达CD13受体的肿瘤组织的特异性结合[16]。

最近，我们报道了新型环状NGR肽及其相应的NGR-药物偶联物的合成和生物化学表征。对化合物的化学稳定性和体外生物活性给予了特别关注[17,18] 。道诺霉素（Dau）用作细胞毒性剂，通过肟键与NGR-衍生物连接。制备的缀合物显示出显着的体外细胞抑制/细胞毒性作用。我们的结果表明缀合物对CD13 + HT-1080细胞和CD13-（但是整联蛋白受体阳性）HT-29人结肠癌细胞具有抗肿瘤作用。此外，我们发现结合物的毒性和选择性高度依赖于它们的结构，细胞摄取和脱酰胺倾向。

具有双重作用特性的最具活性的缀合物是Dau = Aoa-GFLGK（c [KNGRE] -GG - ） - NH 2（K，本研究中的对照缀合物）。在该缀合物中，环状NGR肽通过Gly-Gly二肽间隔物连接至与chatepsin B不稳定GFLG间隔物连接的赖氨酸侧链，其允许溶酶体药物释放。Dau通过掺入的氨基氧基乙酰基（Aoa）部分通过肟键与GFLG间隔基缀合。缀合物的制备需要复杂的合成途径和正交保护基团的使用（图1A）。以前的研究表明Lys的游离ε-氨基对生物活性没有影响[15,17]。为了证明我们的假设，开发了一组新的环状NGR肽-Dau缀合物，其中Lys被不同的氨基酸（Ala，Leu，Nle，Pro和Ser）取代。本研究的主要目的是研究循环中赖氨酸的交换是否对缀合物的化学稳定性，选择性和抗肿瘤活性有任何影响。

在这里，我们报告了环状NGR肽-Dau生物共轭物的合成和表征，包括化学稳定性，溶酶体降解，细胞摄取研究和体外细胞抑制/细胞毒性作用。