用于靶向药物递送的肟键连接的柔红霉素-GnRH-III缀合物的合成和体外生物化学评价
促性腺激素释放激素-III（GnRH-III）是从海鳗中分离的人GnRH的天然同种型，特异性结合癌细胞上的GnRH受体，使其能够用作抗癌药物的靶向部分。最近，我们报道了一种新型柔红霉素-GnRH-III结合物的鉴定（GnRH-III- [ 4 Lys（Bu），8Lys（Dau = Aoa）]具有有效的体外和体内抗肿瘤活性。为了更深入地了解我们的先导化合物的作用机制，细胞摄取之后是共聚焦激光扫描显微镜。因此，通过以时间依赖性方式跟踪药物的定位，可以在不同的亚细胞区室中显现药物柔红霉素。进行共定位研究以证明药物在溶酶体（早期）和其作用位点（10分钟后的细胞核）中的存在。另外的流式细胞术研究表明，在竞争性配体曲普瑞林存在下，生物缀合物的细胞摄取被抑制，表明受体介导的途径。为了比较的目的，已经合成了六种新型的柔红霉素-GnRH-III生物共轭物并进行了生物化学表征，其中6个 Asp被D-Asp，D-Glu和D-Trp取代。除了体外细胞抑制作用和细胞摄取的分析之外，还进行了125 I-曲普瑞林作为放射性示踪剂的受体结合研究和在大鼠肝溶酶体匀浆存在下GnRH-III缀合物的降解。所有衍生物均显示出对GnRH受体的高结合亲和力，并显示出对HT-29和MCF-7癌细胞的体外细胞抑制作用，IC 50值在低微摩尔范围内。此外，我们发现活性药物代谢物的释放和生物缀合物的细胞摄取受到氨基酸交换的强烈影响，而氨基酸交换又影响生物缀合物的抗肿瘤活性。
关键词： 细胞抑制效应; 柔红霉素; 药物靶向; GnRH衍生物; 肟连接
癌症是世界上最严重的疾病之一，恶性肿瘤和转移常常导致高死亡率。化学疗法是一种广泛使用的治疗癌症疾病的方法，但缺乏选择性，药物特异性副作用和对健康组织的毒性导致各种并发症，这限制了化学治疗剂的应用。克服这些缺点的有希望的治疗选择可以是靶向肿瘤治疗。这种方法基于以下事实：许多调节配体（如肽激素）的受体在各种癌细胞表面过表达，包括促性腺激素释放激素受体（GnRH-R）[1]。因此，这些肽适用于靶向肿瘤细胞的特异性药物。该受体的天然配体是GnRH-1（<EHWSYGLRPG-NH2，其中<E是焦谷氨酸），其在下丘脑内合成并释放。GnRH刺激调节性垂体糖蛋白促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）的合成和释放，其作用于性腺并调节性类固醇雄激素和雌激素的产生[2]。
在过去的几十年中，已经设计了大量合成的GnRH-I-类似物，其目的是与受体相互作用并影响垂体促性腺激素LH和FSH的释放[1,3-6]。更换6通过在人GnRH-I d-氨基酸甘氨酸提供像超级激动剂的GnRH-I衍生物布舍瑞林[ 6 d-SER（吨 -Bu），9临-EA]，戈舍瑞林[ 6 d-SER（吨 - Bu），10 Azagly-NH 2 ]，亮丙瑞林[ 6 D-Leu，9 Pro-EA]和triporelin [ 6 ]D-Trp]，用作药物肽，尤其用于治疗激素依赖性前列腺和/或乳腺癌[7]。
自20世纪80年代中期以来，开发并研究了细胞毒性GnRH-I衍生物以治疗肿瘤细胞[4,5,8,9]。蒽环霉素如多柔比星（Dox），柔红霉素（Dau）或表柔比星是常用的抗癌药物。它们的作用方式基于平面环系统，这对于插入DNA很重要[10]。通过这种方式，蒽环类抗生素可以影响广泛的DNA过程，从而导致大分子（如mRNA和DNA）的合成受到抑制[10,11]。更准确地说，蒽环类抗生素作为拓扑异构酶II毒素抑制DNA转录和复制。它们稳定DNA拓扑异构酶-II中间体，其中DNA链被分离，并且拓扑异构酶II的特定酪氨酸残基通过形成酪氨酸磷酸二酯而与DNA共价连接[10-12]。此外，蒽环类抗生素提供有益的自发荧光，允许基于荧光的研究，如共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和荧光激活细胞分选（FACS）的性能，以研究药物或药物生物共轭物的细胞摄取和亚细胞定位[ 13,14]。从文献中众所周知，蒽环霉素在细胞核中积累，因此它们也充当DNA染色剂[14,15]。
在临床前和临床研究中研究的第一种细胞毒性GnRH-I衍生物是zoptarelin-doxorubicin，也称为AEZS-108（以前的AN-152）[16]。蒽环类抗生素多柔比星缀合对GnRH-I- [的ε氨基6由戊二酸连接子的插入d-赖氨酸]。所得的酯键可被羧酸酯酶裂解，导致细胞毒性剂在肿瘤细胞内释放。在临床试验期间，仅观察到由药物过早释放引起的轻微副作用[17]。已经通过使用过量的GnRH-I超激动剂曲普瑞林阻断GnRH受体来研究受体介导的zoptarelin的摄取[14]。。此外，CLSM可视化AN-152的内化和细胞内定位[14]。尽管有这些有希望的发现，但zoptarelin-doxorubicin在子宫内膜癌的3期临床研究中并没有达到其主要终点[18]。
人类GnRH-1的天然同种型，即海鳗类似物GnRH-III（<EHWSHDWKPG-NH 2），由Sower等人鉴定和表征。[19]。由于与GnRH-I相比内分泌效应显着降低以及癌细胞与GnRH-Rs的特异性结合，GnRH-III可能作为细胞毒性药物的载体具有优势，特别是在激素非依赖性肿瘤的情况下[20]。基于这些发现，GnRH-III已被用作靶向肿瘤治疗的有效归巢装置[21,22]。此外，证明了8的侧链的修饰Lys不会阻碍受体结合或抗增殖活性。此外，游离ε-氨基的缺乏另外降低了内分泌效应[23,24]。因此，8 Lys可用作细胞毒性剂如蒽环霉素的缀合位点。在过去十年中，已经进行了各种不同的连接系统，包括酯键或肼键，组织蛋白酶-B不稳定间隔物和肟键[21,22,25]。
由于其结构特性，Dau不能通过酯键如Dox连接到归位装置，因为在C-14位不存在伯羟基。然而，Dox / Dau的C-13羰基提供了合适的缀合位点并且可以用于形成肟。我们最近报道了通过掺入氨氧基乙酸（Aoa）部分，Dau与8 Lys侧链有效连接[21,25]。形成的肟键在生理条件下比酯键更稳定，导致缀合物在循环过程中具有更长的半衰期。然而，该药物通过溶酶体酶在癌细胞内释放，特别是通过组织蛋白酶B释放，导致各种含有Dau的代谢物[26]。。在的GnRH-III-的情况下[ 8个赖氨酸（DAU = AOA）]缀合物由溶酶体降解获得的最小的斗代谢物是的H-Lys（DAU = AOA）-OH，其中能够结合，从而导致细胞毒性作用的DNA。我们的研究小组设计了多种含有GnRH-III药物结合物的肟键，它们对激素依赖性人乳腺癌细胞（MCF-7）和激素非依赖性人结肠癌细胞（HT-29）具有体外细胞毒作用。进行了分析[22,25,27,28]。因此，暴露了4个 Ser与4个 Lys 的交换，然后用短链脂肪酸（SCFA）酰化ε-氨基，改善了细胞摄取和抗肿瘤活性[29]。。此外，这些GnRH-III生物缀合物在胃肠酶存在下表现出增强的稳定性。在人乳腺癌细胞（MCF7）和人结肠癌细胞（HT-29）的体外细胞抑制效应测量中评估的最有效和最有效的生物共轭物是GnRH-III- [ 4 Lys（Bu），8 Lys（ Dau = Aoa）]（K2）。最近的研究表明，位置4赖氨酸的丁酰化不仅导致体外增加，而且导致体内抗肿瘤活性增强[29,30]。
为了更好地理解作用机制，内化和细胞内定位，我们的先导化合物K2由CLSM进行研究和监测。此外，通过流式细胞术指示受体介导的途径，在与GnRH-I超级激动剂曲普瑞林的竞争中评估K2的细胞摄取。
为了获得关于GnRH-III的序列 - 活性关系的进一步信息，我们研究了6个 Asp对肿瘤靶向效率的影响。由于从文献中已知在GnRH-I和II肽的第6位掺入D-氨基酸（D-Aaa）可以导致改善的受体结合亲和力和增强的抗增殖活性而对内分泌活性没有实质性影响。[31-33]，我们开发了六种新的GnRH-III-Dau偶联物，其中6个 Asp被D-Aaa取代。在这里，我们报告了GnRH-III生物共轭物的合成，其中第6位含有D-Asp，D-Glu或D-Trp，第4位含有Ser或Lys（Bu）。此外，系统地比较了新型GnRH-III-Dau偶联物。用我们的先导化合物K2 就大鼠肝溶酶体匀浆存在时的体外细胞抑制作用，受体结合亲和力，细胞摄取和溶酶体消化而言。