用于核酸中碱基FRET的荧光核碱基类似物：合成，光物理学和应用

供体核碱基类似物和受体核碱基类似物（碱基FRET）之间的Förster共振能量转移（FRET）可用作光谱尺和量角器。由于它们具有牢固的堆积和替代碱基堆叠内的天然核酸碱基的能力，碱基类似物供体和受体分子补充外部荧光团，如Cy-，Alexa-和ATTO-染料，并能够详细研究核酸的结构和动力学。包含系统。第一个碱基FRET对，tC O -tC 硝基，最近补充了其中的腺嘌呤类似物FRET对，qAN1-qA nitro，增加了方法的灵活性。在这里，我们介绍了这种碱类似物的设计，合成，光物理表征和用途。它们使FRET取向因子的更高的控制，κ 2，具有与外部荧光团不同的距离窗口，因此具有促进更好的结构分辨率的潜力。Netropsin DNA结合和B-to-Z-DNA转换是最近使用碱基FRET进行的结构研究的实例，并且在此描述。基础FRET已经存在不到十年，仅在2017年扩展到超过一个FRET对，并且代表了核酸领域非常有前途的结构和动力学方法。在这里，我们提出它的优点和缺点，并触及潜在的未来应用。

关键词： B-to-Z-DNA转换; 荧光碱类似物; 烦恼; 纺锤菌素; 核酸结构和动力学; 四环腺嘌呤; 三环胞嘧啶; Z-DNA

核酸结构和动力学在理解生物体中重要过程中的重要性导致了大量用于此类研究的技术的发展。其中最重要的是NMR [1]和X射线晶体学[2]。两种技术都提供高结构分辨率，NMR也可以提供动态信息。然而，有时NMR和X射线晶体学存在缺点：样品量要求和NMR的生物分子尺寸限制以及获得晶体的困难和X射线晶体学明显缺乏溶液动力学。生物分子结构和动力学研究的一种重要方法是通过较低分辨率补充核磁共振和X射线，是Förster共振能量转移（FRET）[3,4]。FRET，特别是单分子FRET（作为研究中的少量生物分子的作用）具有能够在活细胞中进行结构和动力学研究的优点[3,5,6]。FRET是一个依赖于供体和受体分子之间无辐射能量转移的过程[7]。它可以用作结构和动力学技术的原因在于它在很大程度上取决于供体和受体之间的距离和相对取向。可监测的典型距离范围在15-90埃之间，与生物分子的尺寸很好地匹配。通过比较存在和不存在受体分子的荧光特性，可以使用稳态或时间分辨荧光光谱法建立能量转移过程（E，0和100％之间）的效率。该效率（E）取决于距离（R DA）如公式1所述，在供体和受体之间：

其中R 0是Förster距离（等式2），供体 - 受体对的特征距离，其中能量转移效率（E）为50％。

如可在可见等式2福斯特距离取决于给体（Φ的量子产率d），供体/受体的光谱重叠积分（Ĵ DA，供体发射与受体吸收的包络的能量之间重叠），的折射率介质（n），重要的是几何因子（κ，等式3）。这个因素需要供体和受体的跃迁偶极矩的相对定向考虑在内，因此，引入了一个方位依存性，以[R 0，因此也对能量传递效率，ê。取向因子的范围在0到4之间，取决于公式3：

其中e 1和e 2是供体和受体跃迁偶极矩的单位矢量，e 12是它们中心之间的单位矢量（见图1a ;κ也可以用图1a中的角度表示：κ= cosφ - 3 COS θ 余弦 ω）。

在大多数FRET应用中，取向因子κ 2使用的2/3。这是自由旋转，各向同性供体和受体分子取向的正确值（图1b）。在整个实验中，通过供体和受体的各向同性取向，能量转移效率（E）与距离直接相关，并且该技术变成光谱尺。这种假设经常是正确和错误的[8-10]，用于共价连接的外部核酸荧光团，如Cy-，Alexa-和ATTO-染料。这为测量含核酸系统中的长距离范围（通常为35-90）提供了强有力的手段。然而，随着供体和受体的自由旋转，FRET监测它们之间取向变化的能力也丧失了。几乎静态供体和受体分子（图1c）κ 2可以被用来改善通过引入的取向的信息，即，结构的分辨率，FRET也将作为分光量角器。一些调查，包括Tor等人的调查。[11]，Lewis等人。[12]和Lilley等人。[13]，在将取向信息引入核酸FRET方面迈出了重要的一步。最近，我们小组进一步推进了这一进展并引入了碱基FRET [14]，其中供体和受体分子是核碱基类似物[15,16]。由于供体和受体分子刚性堆叠在核酸的碱基堆叠中（图1c），该方法提供高度准确的定向信息，并且具有增加在核酸FRET实验中获得的结构和动力学信息的潜力。后来Asanuma等人。引入碱基堆积的芳香族部分[17]，不作为核碱基类似物，也可用于提供有关取向的信息。

在这次审查中，我们将重点荧光性碱基类似物，即基本基础FRET，它背后的理论，在取向因子增加的准确性κ之间的FRET 2作为其位置的碱基堆栈内的效果，其它的优点和缺点与使用外部荧光团如Cy-，Alexa-和ATTO-染料的核酸中的FRET相比，并最终总结了其最近的一些应用。该领域在不到十年前开始引入第一个荧光核碱基类似物FRET对，tC O -tC nitro，我们将这篇综述分为三个部分：第一部分涉及基础FRET的关键参与者的合成，即基础模拟供体和受体分子，第二部分涉及它们的光物理性质，第三部分处理它们的光物理特性。用于研究含核酸系统。

荧光碱类似物的合成

核碱基类似物合成方法的开发仍然是一个挑战。这主要是由于在核碱基以及糖部分上存在多个反应性官能团，并且需要引入正交保护基团。仔细考虑保护组是至关重要的，因为广泛使用会增加额外的步骤以及合成的复杂性。荧光核碱基类似物（FBAs）的设计和合成增加了额外的挑战，例如获得引入有用的光物理性质的特征，例如扩展的缀合。由于需要氢键性质，尺寸限制和空间效应，这些要求往往相互矛盾[15,18,19]。然而，自从Ward等人的开创性工作以来，有越来越多的例外。关于腺嘌呤类似物[20]对核碱基的一系列小修饰，如8-乙烯基脱氧腺苷[21]，导致了荧光的引入。考虑到嘌呤和嘧啶结构的差异，腺嘌呤在天然碱基中是独特的，因为它提供了几个修饰位点：C2，C8，C6环外氨基官能团和广泛研究的N7至C7取代导致7-脱氮腺苷。相反，对于鸟嘌呤，只有C8和C2环外胺可直接进行修饰以及前面提到的7-脱氮取代。观察单环嘧啶，只有C5和C6位置可用于修饰而不直接扰乱碱基配对性质。一类核碱基之间的微妙差异可能使人们相信，为修饰腺嘌呤而开发的化学反应很容易转化为鸟嘌呤。不幸，各种官能团需要不同的保护基团策略，而且，改变核碱基的反应性。自从发现荧光碱类似物的金标准2-AP以来，已经出现了大量的腺嘌呤FBA[22]。值得注意的最近腺嘌呤FBA的（参见实施例图2为化学结构）包括C8至S8硫代RNA类似物次甲[23] ，取代的C8萘腺嘌呤CN A和DN甲[24] ，以及我们自己quadracyclic qAN1 [25]。荧光鸟嘌呤类似物的少数已经合成和表征，包括最近的接通探针BFdG，3-MI，2PyG，以及作为发射RNA类似物个 ģ [23,26-28] 。一些值得注意的嘧啶类似物包括我们的三环类似物tC和tC O [29-31]，吡咯并-dC [32]及其衍生物[33]以及第 U，第 Ç [23]和DMA Ç [34] 。除了的tC，TC Ó，qAN1和第 G，FBA的尚未在碱基使用FRET的应用程序。然而，这些最明亮的这些FBA与匹配的供体或受体分子相结合，未来也可能用于基础FRET。