做药物研发、分析的小伙伴对生物碱肯定不陌生，对它的检测难度肯定也不陌生。是什么导致的生物碱测定困难呢？有什么好的解决吗？今天就和大家好好聊一聊关于碱性化合物检测困难的原因，以及相应的解决办法。生物碱是天然产物中药用活性较好的一类化合物，大量地存在于植物当中，也有部分存在于动物中。
早在19世纪初, 植物化学家就一直致力于生物碱的纯化制备, 通过溶剂萃取、硅胶柱层析、结晶等植化手段获得了大量生物碱, 并开发出众多的碱性药物。但由于传统技术的局限, 对生物碱分离、纯化的收率往往很低， 直到高效液相色谱的出现，才让科学家对生物碱的分离看到新的希望，然而，在液相色谱的分离检测过程中也出现了诸多问题。
最主要的就是峰形拖尾，由于生物碱往往峰宽较宽，峰高较矮，检测灵敏度较差，而提高进样量又会导致色谱峰拖尾加剧，柱效迅速降低，相邻的成分更容易被拖尾峰包裹等等，这一些问题，都为碱性化合物的检测带来难度。
今年来，科学家们一直在寻找造成碱性化合物的峰形拖尾的原因，以及相应的解决办法。
我们都知道，高效液相色谱分析的 3 个最基本要素是固定相、流动相、目标分析物。因此，不难得出：碱性化合物的拖尾现象，与这三个要素息息相关，任何一个环节出在非理想状态，都会导致拖尾的现象出现。接下来，咱们就从这固定相和流动相入手，分别讨论可能的原因，探寻出拖尾的真相。
C18 色谱柱是反相分析方法中最常用的色谱柱。C18，十八烷基键合硅胶，是将十八烷基链键合在硅胶上而得。但是，由于十八烷基碳链很长，键合的时候空间位阻非常大，导致键合率不高，这样，便会残留大量未被键合的硅羟基。硅羟基在一些反相流动相中，容易解离。
由于硅胶键合相容易溶解在碱性介质中，因此，大多数的反相 HPLC 方法都是在酸性或者中性的流动相条件，碱性化合物在酸性或者在中性流动相环境下，由于解离平衡的关系，便会以离子形式存在，带正电荷。碱性越强，解离越容易。由于游离的硅羟基与解离后碱性化合产生的二级作用，导致了碱性化合物峰行出现拖尾现象。
分析碱性化合物时，选择硅羟基活性小的键合相是获得良好峰形的关键。超纯硅胶成了固定相的首选材料，一般都有 99.99%以上的纯度，金属残留量极低，使得键合率增加，游离的硅羟基减少。为了进一步降低游离硅羟基的活性，许多科学家都做了大量的研发工作，直到1999年，默克公司基于超高纯硅胶，推出了一款聚合封尾技术的液相色谱柱Purospher® STAR RP-18e。目前，端基封尾技术是解决这一问题最有效的办法。
所谓的端基封尾，即在完成键合之后，再用一个小分子的化合物，如三甲基硅氧烷（TMS）,把剩余的游离硅羟基尽可能多得键合上去，这样便可以进一步降低硅羟基的活性。
同时，分析碱性化合物的色谱柱还需要较宽pH值耐受范围；以及可以耐受100%纯水相（适用于反相条件下，极性化合物的保留和分析。）
Purospher® STAR RP-18e在pH 10.5分析条件下的稳定性Purospher® STAR RP-18e在100%纯水相条件下极性化合物分析的稳定性由此可见，使用正确、具有针对性的液相的谱柱可以完美地解决碱性化合物峰拖尾这一难题。除此之外，优秀的液相色谱柱还应该具有超低的柱流失，还可以搭配通用型检测器（包括LC-MS分析）等优点。Purospher® STAR RP-18e可为LC-MS分析提供超低柱流失
另外，碱性化合物拖尾的另一个原因是键合过程中残留的卤代集团造成的。键合相的合成一般是将卤代硅烷化烷烃和在交联硅胶通过置换作用，生成键合相。由于卤代基的强电负性，表面会成负电荷模式，与碱性化合物形成二级反应，造成拖尾。通过调节流动相去改善碱性化合物的峰形也是一个必要方式。可以从以下4个方面进行调整。使用离子对试剂增强碱性化合物的保留，改善碱性化合物峰形。适合碱性化合物的离子对试剂有庚烷磺酸钠、己烷磺酸钠、十二烷基烷磺酸钠等。
酸性条件下，碱性化合物的阳离子会和烷基磺酸根阴离子形成中性离子对，使碱性化合物变成中性化合物，并增强疏水性。
最常用的扫尾剂是三乙胺，有时也可以使用二乙胺。当我们发现碱性化合的峰形出现拖尾时，在流动相里添加1%左右的三乙胺，再用磷酸把流动相调回酸性，往往可以起到立竿见影的效果。
酸性条件下，三乙胺阳离子和键合相中游离的硅羟基结合，占据键合相中所有与碱性化合物作用的活性中心，屏蔽碱性化合物的二级作用，改善峰形。当遇到碱性比三乙胺更强的碱性化合物时，三乙胺的作用就不明显了。
对碱性化合物来说，流动相的 pH 不仅仅对峰形，还对保留因子和选择性都有很大影响。一般来说，我们建议碱性化合物的流动相 pH≤2.5,会有比较好的峰形。
b.pH≤2.5 会使固定相游离硅羟基解离受抑制，减小对碱性阳离子的二级反应。
当pH=2.5 的时候，解离平衡向左移动，非解离状态的构型会比平衡状态时增加 90%，解离状态的构型降为平衡状态时的 10%。
使用缓冲盐的目的主要有两点，其一是使流动相维持在一个相对稳定的 pH 条件；其二是使流动相具有足够的离子强度。那么，选择缓冲盐的类型和浓度就非常重要了。
高浓度缓冲盐中金属离子“包裹”游离硅羟基，并呈正电状态，阻断碱性化合物与固定相的二级反应，减小拖尾，改善峰形。缓冲盐的弱酸根（阴离子）作用是维持流动相体系在一个稳定的 pH 环境，提高方法重现性。
说了这么多，解决问题的关键还是选择正确的色谱柱，希望小伙伴在做碱性化合物分析的时候，可以挑选具有针对性的色谱柱，避免浪费人力物力，节约实验成本。注：Purospher® STAR RP-18e除了可以解决碱性化合的检测难题，对配位化合物的检测问题也是“药到病除”。
Purospher® STAR RP-18e为配位化合物分析提供完美峰形
Purospher® STAR还有RP-8e/Phenyl/NH2/Si等键合相产品。
以上的所有办法，未必能解决实际分析中的所有问题，我们只是希望能起到抛砖引玉的作用，可以启发色谱分析从业人员，特别是一些“新手”，使你在碰到问题的时候，可以结合待测样品的实际情况，尝试自己去分析可能的影响因素，并有针对性的探索出解决方案。
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