对马来丝虫 DSM4137（cle）的克霉素进行了生物合成基因簇测序

我们以前[10]对马来丝虫 DSM4137（cle）的克霉素进行了生物合成基因簇测序; 我们现在还通过菌株的全基因组测序对来自S. mediocidicus（med）的mediomycins A和B的簇进行测序。先前未知马来酸硫霉素和去磺基谷胱甘肽由马来西亚马来丝虫 DSM4137 产生，但是通过高分辨率质量分析容易证实细胞提取物中这些代谢物的特性（图S1，支持信息文件1）。med集群和cle中基因和蛋白质的特性表S4（支持信息文件1）总结了集群。两个基因簇都编码一个巨大的模块化PKS壳体27个扩展模块，分布在九个PKS亚基上（方案2）。这正是基于1a - d的已知结构预测的扩展模块的数量。详细比较我们的Cle PKS [10]和Med PKS 的氨基酸序列与最近报道的S. blastmyceticus 的Med PKS序列[8]在每种情况下，在整个PKS中显示出高度的氨基酸序列同一性（≈96％同一性），并且在酮合成酶（KS），酰基转移酶（AT），酮还原酶的每个特征活性位点序列基序中基本上完美保守序列。 27个扩展模块中的每一个的（KR），脱水酶（DH）和烯酰基还原酶（ER）结构域，包括三种PKS多酶之间新识别的活性DH结构域的YGP基序[8]。方案1中显示的1a - d的立体化学是从生物合成分析预测的; 与实验确定的中间霉素中立体中心的相对构型完全一致[7,8]。侧翼基因也大部分几乎相同，包括似乎标记簇的一个边界的磺基转移酶（slf）基因。然而，在cle簇中存在额外的推定的调节和输出基因，以及显着地，插入到簇中的一组六个基因，其被预测用于控制羊毛硫抗生素的生物合成（方案2）。

在cle和med簇之间预期的关键差异是存在必需的脒基水解酶基因，编码一种酶，该酶将在揭示mediomycins的伯氨基的途径的后期起作用，正如我们之前描述的那样。生物合成氨基马来酸内酯抗生素[10]。然而，仔细审查med生物合成基因簇中PKS侧翼的开放阅读框未能揭示任何其产物可能被合理地解释为脒基水解酶。报道的S. blastmyceticus med簇也缺乏预期的脒基水解酶[8]。因此，我们试图通过BLAST分析[15]我们几乎完整的S. mediocidicus基因组序列找到“缺失的”脒基水解酶，使用来自线性多烯的生物合成基因簇的推定的脒基水解酶（Orf32）的蛋白质序列作为探针。 ECO-02301（方案1）[16]。该分析返回两个强匹配，Medi4948（80％同一性，93％相似性）和Medi2865（82％同一性，92％相似性），两者都临时注释为agmatinases（引用的数字是指基因组序列中相应orf的位置） ）。下一个最佳匹配是另一种agmatinase Medi0234（41％同一性，57％相似性）。克隆这三种基因中的每一种并在大肠杆菌中表达如实验部分所述，作为N-末端组氨酸标记的蛋白质，并在Ni-NTA柱上通过色谱法纯化。推定的脒基水解酶Medi2865和Medi0234在与从DSM4137提取物纯化的脱磺纤维素（1b）孵育时完全无活性，尽管Medi2865确实显示出对4-胍基丁酸酯的金属依赖性脒基水解酶活性，产生4-氨基丁酸酯。相反，短暂孵育后的重组Medi4948基本上完全将纯化的1b转化为中间霉素B（1d，见后文）。编码该酶的基因位于距离S. mediocidicus染色体上的med基因簇670kbp处（方案2），一个罕见但不是前所未有的[17]例子，显然必需基因远离相关基因簇。由于S. mediocidicus菌株对克隆DNA的引入具有高度抗性，因此我们无法通过突变medi4948并观察1a和/或1b的积累来获得该基因对于中间霉素生物合成必不可少的正式证据。相反，我们将表达载体pIB139 [18]中克隆的medi4948基因导入DSM4137。如图1B所示，在该重组体的培养颗粒的提取物中，该菌株1a和β的正常产物1b不存在，并被mediomycins 1c和1d取代，完全符合基因medi4948编码的脒基水解酶的功能。相反，当产生大环多烯荒沙霉素[10]的StreptomycesolivaceusTü4018菌株的真正脒基水解酶同样克隆并在马来西亚马来丝虫 DSM4137中表达时，它对1a和1b的产生没有影响（图S6，支持信息文件） 1），暗示这些在线性和大环多烯上作用的脒基转移酶不具有重叠的底物特异性。氨基水解酶Medi4948与蛋白质数据库（PDB）中的真实脲水解酶的序列比对（图S2，支持信息文件1）显示其含有序列基序xGGDH，DAHxD和SxDxDxxDPxxxP（其中x =任何氨基酸），其是保守的在这种酶超家族中，与阳离子结合和催化有关[19-22]。

我们发现由medi4948基因编码的脒基水解酶在体内作用于脱硫谷氨酰霉素（1b）和clethramycin（1a），提出了在S中的mediomycins的后期定制中是否存在优选的或甚至是强制性的事件顺序的问题。 mediocidicus。为了解决该问题，我们试图表征由马来西亚马来丝虫 DSM4137和S.mediocidicus中的多烯簇相关的slf基因编码的推定的磺基转移酶（表S4，支持信息文件1）。多烯簇相关SLF在基因S.的马来西亚如实验部分所述，DSM4137（smala2697）特异性地在框内删除。在野生型同时产生1a和1b的条件下，所得突变菌株仅产生1b（图2B），表明slf基因独特地负责将脱磺谷蛋白转化为克霉素。用来自DSM4137 的