mycolactones的生物学作用和作用机制

虽然布鲁里溃疡与感染部位广泛的脂肪细胞坏死有关，但溃疡通常伴有最小的疼痛或炎症反应。这些宏观观察反映了mycolactones的细胞毒性[32]，免疫抑制[35,77]和镇痛[78]特性。虽然这些性质似乎相当普遍，但是mycolactone促进的作用仍然是多方面的，并且很大程度上取决于所研究的细胞系。在Sarfo等人最近的综述中可以找到细胞类型特异性作用的详细讨论。[79]。因此，这里将简要讨论霉菌内酯的细胞效应，同时重点放在它们的分子靶标上。

即使在非常低的无毒浓度下，纯的mycolactones或溃疡分枝杆菌培养物上清液也抑制先天性和适应性免疫应答。例如，mycolactone治疗导致人单核细胞[77,80]和T淋巴细胞[77]中细胞因子表达水平显着降低，尽管并非所有细胞因子都受到影响[81]。事实上，mycolactone介导的免疫反应下调和预防感染部位炎症细胞的募集可能对布鲁里溃疡的发病机制至关重要[35,81]。随着浓度的增加，mycolactone的细胞毒性作用变得更加突出。这些通常伴随着细胞骨架的深刻结构变化，随后在G 0 / G 1期中细胞周期停滞。最终，在体外和体内观察到细胞死亡，主要是通过细胞凋亡[32,33,82]。值得一提的是，在某些细胞类型中，例如脂肪细胞，通过坏死导致的细胞死亡优于细胞凋亡[83]。

用于研究mycolactones的致细胞病变性的最常用细胞是鼠L929成纤维细胞，其对霉菌内酯敏感。当暴露于低至0.025 ng / mL（0.034 nM）的天然mycolactone A / B浓度时，L929细胞在12小时显示细胞骨架重排，细胞在24小时内变圆，48小时后粘连丧失以及生长停滞[32]。此时，毒素的作用似乎仍然是可逆的，因为洗过的细胞能够再生。长时间暴露（3至5天）后，鼠L929成纤维细胞在低至3 ng / mL（4 nM）的mycolactone A / B浓度下发生凋亡，而非常高的浓度（15μg/ mL）通过4内的坏死导致细胞死亡ħ [35]。有趣的是，泛半胱天冬酶抑制剂Boc-Asp（OMe） - 氟甲基酮[84]的加入阻止了细胞凋亡，同时观察到正常的细胞病变效应和随后的坏死细胞死亡。Mycolactone A / B对角质形成细胞[85]，树突[81]和内皮细胞[86]也具有高度细胞毒性，而T细胞[87,88]和巨噬细胞[80,89]敏感性较低。引人注目的是，没有观察到针对人肝癌HuH7或人胚肾HEK293 T细胞的毒性[85]。有趣的是，mycolactone A / B缺乏抗菌活性[90]这表明对抗竞争微生物的防御不是毒素出现的进化驱动因素。

文献中通常认为，mycolactones通过被动扩散到达其细胞靶标[91]。基于荧光，硼二吡咯甲烷（BODIPY）标记的mycolactone类似物12（图5）的竞争实验，其通过化学修饰天然的mycolactone A / B（1a，b）获得，Synder和Small得出结论，mycolactone吸收是非 - 竞争力和不可饱和度。该化合物快速穿透L929成纤维细胞并且似乎定位于细胞质中，没有任何与细胞核，线粒体或肌动蛋白的显着结合是可检测的。Blanchard及其同事使用全合成的8-去甲基肌内酯类似物获得了类似的结果13，带有BODIPY标签作为核心扩展的部分替代[92]。根据来自Demangel组的未发表的数据，在暴露于14 C标记形式的毒素的人淋巴细胞和上皮细胞中获得了确凿的结果[63]。

到目前为止，已发现几种分子靶向的mycolactone（A / B），第一种是Wiskott-Aldrich综合征蛋白（WASP）和Demangel和co发现的相关神经元Wiskott-Aldrich综合征蛋白（N-WASP）。 - 工作者在2013年基于生物素化的mycolactone探针实验[93]。WAS家族包含五种支架蛋白，这些蛋白质主要参与肌动蛋白细胞骨架的动态重塑[94]。虽然N-WASP普遍表达，但WASP仅存在于造血谱系细胞中，并且似乎与免疫系统的调节密切相关[95]。。WASP和N-WASP以基础自身抑制状态存在，这是一种封闭构象，其中C末端verprolin同源性，cofilin同源性和酸性（VCA）区域与位于N末端的对照区域相互作用[96]。在细胞分裂对照蛋白42同源物（CDC42）和磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）的协同结合后，诱导构象变化，这允许（N-）WASP VCA结构域结合并激活细胞骨架组织复合物。 ARP2 / 3，反过来刺激肌动蛋白聚合。发现Mycolactone A / B与N-WASP的CR1结构域和WASP的CR7结构域结合约100倍（K d）在两种情况下均= 20-70nM）比天然配体CDC42，因此引发不受控制的ARP2 / 3介导的肌动蛋白组装。因此，mycolactone A / B导致细胞粘附受损和上皮细胞迁移缺陷（例如，伴随失去方向性的细胞运动性增加）。还通过荧光的mycolactone衍生的探针证明了mycolactone与WASP的结合，所述探针在Jurkat T细胞中与活性WASP共定位很小但很显着。同时，wiskostatin，一种已知的N-WASP抑制剂[97]被发现可以抵消mycolactone的一些影响（例如，HeLa细胞中细胞粘附受损）。Wiskostatin还抑制了小鼠模型中由mycolactone引起的皮肤变薄，从而表明N-WASP过度活化确实与布鲁里溃疡中的表皮破坏密切相关。不幸的是，目前还没有关于WASP结合的mycolactone的X射线或NMR数据，因此在分子水平上mycolactone和WASP之间的相互作用仍然是难以捉摸的。

最近，Simmonds及其同事[89,98]提供了证据表明mycolactone对Sec61易位子具有强烈的抑制作用。该组早期对人单核细胞的研究表明，炎症介质如细胞因子（如TNF，IL-1β，IL-6，IL-10和IP-10），趋化因子（如IL-8）的产生和COX-2等效应分子被亚毒性剂量的纯化天然mycolactone抑制，相应的mRNA水平没有任何变化[80]。因此提出转录后机制以解释mRNA和蛋白质水平之间的差异。Demangel及其同事后来得出了类似的结论[87]; 然而，有趣的是，mycolactone暴露仅影响人单核细胞中蛋白质组的一部分。随后对人类RAW264.7巨噬细胞的研究导致了这样的假设：mycolactone A / B不会阻断翻译，而是阻止分泌蛋白转运到内质网（ER）[89,99]。未转移到ER中的新生分泌蛋白通常被26S蛋白酶体快速降解。与此一致，在蛋白酶体抑制剂存在下的mycolactone处理恢复了RAW264.7细胞中的COX2和TNF产生，并且在胞质溶胶中发现了两种蛋白质。

分泌蛋白向ER的易位由Sec61复合物介导，Sec61复合物是由三个单体亚基Sec61α，β和γ组成的蛋白质导电通道。在几种易位测定中证实了由mycolactone阻断Sec61易位子。在LPS刺激后在RAW264.7细胞中产生的18种细胞因子中，17种几乎完全被霉菌内酯抑制，通常具有约60nM的IC 50值。代谢标记实验表明，mycolactone暴露导致几乎完全阻断分泌和N-糖基化蛋白的产生，这些蛋白通常在ER中加工[100]。。相反，仅检测到细胞溶质蛋白水平的微小变化。用人真皮微血管内皮细胞（HDMVEC），鼠L929成纤维细胞和HeLa细胞获得了类似的结果。然后，无细胞系统中的机理研究表明，mycolactone有效抑制多肽共转录到ER的转运，而短分泌蛋白（SSPs）的翻译后，核糖体非依赖性易位仅受到部分影响。与交联实验的结果一起，这些数据表明，mycolactone干扰核糖体 - 新生链（RNC）-Sec61复合物。最近Demangel及其同事的一项独立研究得出了类似的结论，[101]在T细胞中，mycolactone A / B是一种广谱的Sec61抑制剂[102]。Sec61上的mycolactone结合位点似乎位于Sec61α亚基的腔塞附近，因为Sec61α中的Arg66突变为Gly使Sec61对mycolactone不敏感。这种突变体在T细胞中的表达恢复了其归巢潜能和效应功能，而巨噬细胞中的表达恢复了它们的IFN-γ介导的杀菌反应，这是早期宿主防御的关键因素[103]。

有趣的是，根据Simmonds和Demangel组的数据，WASP似乎并未对mycolactone的免疫抑制作用起主要作用。WASP抑制剂wiskostatin也没有恢复分泌蛋白的产生，也没有通过RNA干扰沉默（N）-WASP改变了mycolactone对分泌和膜蛋白产生的抑制。

血管紧张素通路在2014年被Brodin及其同事确定为mycolactones的第三个靶点[104]。一段时间以来，人们都知道，mycolactone是导致局部镇痛和溃疡性溃疡感染病灶无痛的原因[78]，这种现象直到最近才被认为是神经束的破坏[78,105]。然而，这种假设似乎与神经损伤仅发生在感染晚期的事实不一致，而病变从一开始就是无痛的。事实上，Brodin及其同事可以证明注射mycolactone A / B（1a，b）或表达GFP的M. ulcerans小鼠足垫中的突变体与快速发作的镇痛相关，该镇痛是可逆的并且不伴有神经破坏和感觉减退的宏观或超微结构迹象。随后的实验显示，mycolactone暴露引起由TRAAK钾通道介导的源自PC12细胞的神经元的超极化。最后，筛选靶向8000个宿主基因的siRNA文库，鉴定出血管紧张素II型受体（AT 2 R）作为mycolactone的分子靶标，其通过体外和体内基因敲除以及化学抑制来证实。在竞争结合试验中，mycolactone能够取代有效的放射性标记激动剂[ 125 I] -CGP42,112A（K d = 0.01 nM）[106,107]，IC 50值为3μg/ mL（相当于4μM）。mycolactone A / B与AT 2的结合发现R引发磷脂酶A2的活化，导致花生四烯酸的释放。后者可以转化为前列腺素E2（PGE2），其显示激活TRAAK通道。与该机制模型一致，发现环氧合酶（COX）1和前列腺素-E合酶2（其是花生四烯酸PGE2生物合成的核心）对于mycolactone介导的超极化是必需的; 相反，COX2活性的遗传或化学消除是无关紧要的。Brodin及其同事的结论最近受到Anand及其同事的挑战，他们描述了mycolactone A / B对人和大鼠伤害性背根神经节（DRG）神经元的破坏作用[108]。此外，mycolactone处理的DRG神经元显示辣椒素反应的可逆和剂量依赖性下降，可能表明mycolactone A / B与瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1（TRPV1，香草素受体1）的相互作用[109]。另一方面，与血管紧张素II或AT 2 R拮抗剂EMA401 共同治疗[110]并没有改变由mycolactone引起的形态和功能缺陷，因此质疑血管紧张素II受体在mycolactone促进中的作用。镇痛。

最近，Pluschke实验室与我们自己的小组合作，确定了哺乳动物（最近：机械）雷帕霉素（mTOR）途径的目标，作为布鲁里溃疡发病机制的关键参与者[111]。作为细胞命运决定的主要调节剂，mTOR与不同蛋白质相互作用以形成多蛋白复合物mTOR复合物1和2（mTORC1和2），其触发不同的下游信号级联。作为这些复合物的核心成分，mTOR表现出蛋白激酶活性并使多种下游冥醇蛋白磷酸化。mTORC2复合物的主要底物之一是丝氨酸/苏氨酸激酶Akt，其在Ser473磷酸化后被激活[112]。。mTORC2复合物的破坏或其激酶活性的抑制通过去磷酸化导致Akt失活，导致Akt靶向转录因子的去磷酸化和活化，包括叉头盒O1和O3（FoxO1和FoxO3）[113,114]。转移至细胞核后，去磷酸化的FoxOs诱导靶基因如BCL2L11的表达，其编码促凋亡Bcl-2样蛋白11，也称为BIM。此外，FoxOs可通过Fas死亡受体信号通路触发细胞凋亡[115]。在早期研究中，我们研究了合成的mycolactone A / B对用泛半胱天冬酶抑制剂Z-Val-Ala-Asp- [OMe] - 氟甲基酮（Z-VAD-FMK）预处理的L929成纤维细胞的毒性[116]，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤[117]和necrostatin 1 [118]，程序性坏死的抑制剂，发现mycolactone处理的细胞死于细胞凋亡。有趣的是，加入了威斯抑抑菌素，之前已证实可以抵消麦克朗内酯的细胞毒作用[93]，甚至增强了霉菌内酯的毒性。通过使用参与调节细胞凋亡，自噬和坏死的84个基因的实时PCR（qPCR）筛选，观察到编码仅BH3蛋白Bim和Fas受体的mRNA转录物的强烈增加。两者均转化为相应蛋白质水平的增加和凋亡标记物如裂解的胱天蛋白酶3和8的出现，其与肌内酯介导的细胞凋亡的时间过程良好相关。通过RNA干扰沉默Bim和Fas证明Bim是mycolactone介导的细胞凋亡的关键驱动因素，而Fas上调可能代表被动的旁观者效应。基于这些结果并考虑到mycolactone与雷帕霉素的远程相似性，mTOR途径被认为是潜在的分子靶标。把这个假设考验一下，在L929成纤维细胞和Jurkat T细胞中研究了mycolactone处理对mTORC1靶向核糖体蛋白S6（rpS6）和mTORC2靶向激酶Akt的磷酸化的影响。引人注目的是，mycolactone治疗取消了S6和Akt的磷酸化。由于mycolactone A / B不直接干扰mTOR的激酶活性并导致mTORC1 / 2信号传导能力的时间依赖性逐渐丧失，因此假设mycolactone干扰mTOR复合物组装。在mycolactone处理后的不同时间点通过各自mTOR复合物的免疫沉淀证实了该假设。值得注意的是，雷帕霉素阻断了mTORC2的装配 S6和Akt磷酸化。由于mycolactone A / B不直接干扰mTOR的激酶活性并导致mTORC1 / 2信号传导能力的时间依赖性逐渐丧失，因此假设mycolactone干扰mTOR复合物组装。在mycolactone处理后的不同时间点通过各自mTOR复合物的免疫沉淀证实了该假设。值得注意的是，雷帕霉素阻断了mTORC2的装配 S6和Akt磷酸化。由于mycolactone A / B不直接干扰mTOR的激酶活性并导致mTORC1 / 2信号传导能力的时间依赖性逐渐丧失，因此假设mycolactone干扰mTOR复合物组装。在mycolactone处理后的不同时间点通过各自mTOR复合物的免疫沉淀证实了该假设。值得注意的是，雷帕霉素阻断了mTORC2的装配[119]遵循与mycolactone A / B观察到的相似的时间过程。随后对L929全细胞裂解物进行Western印迹分析证明，在肌醇内酯处理12小时后，Akt靶位点处的FoxO3磷酸化完全消失，这与Akt失活的时间过程一致。根据这些结果，组成型活性Akt（Myr-Akt）的稳定过表达[120]从mycolactone促进的细胞凋亡中拯救L929成纤维细胞，而通过RNA干扰沉默FoxO3仅部分保护。后一发现可能是由其他FoxO蛋白的补偿效应所解释的。两个合成的mycolactone衍生探针带有生物素标签作为下侧链的替代品（15）或附着在核心延伸的C20（ 图16，图6）用于研究霉菌内酯是否以与雷帕霉素类似的方式抑制mTOR信号传导。已知后者与FK506结合蛋白FKBP12结合。引人注目的是，使用这两种工具化合物在L929全细胞裂解物中进行目标捕捞，在用16获得的沉淀物中鉴定出FKBP12 ，但未用15获得。与这些观察结果和已发表的SAR（参见下文）[90]一致，简化模拟14具有截短的下侧链不会导致mTORC2活性的抑制或Bim的上调。此外，mycolactone A / B与FKBP12的建议相互作用得到了过量FK506对mycolactone诱导的细胞凋亡的保护作用的支持。然而，例如通过SPR，NMR或X射线晶体学进一步实验验证mycolactone-FKBP12相互作用将是非常值得注意的。最后，我们还证明了mycolactone触发的Bim介导的细胞凋亡在体内的关键作用。为此，野生型（WT）和纯合Bim和Fas敲除小鼠（Bim - / -和Fas - / -）的食物垫用溃疡分枝杆菌感染。有趣的是，WT和Fas - / -小鼠显示典型的布鲁里溃疡表型，而Bim - / -小鼠缺乏典型的布鲁里溃疡样症状。此外，Bim - / -小鼠能够包含溃疡分枝杆菌感染，表明如果它们没有被排泄的毒素杀死，则浸润的吞噬细胞能够消除溃疡分枝杆菌。