曙红Y（EoY，2）和曙红B（EoB，4）的合成

从不同供应商购买的市售染料曙红Y和曙红B的纯度（测试每种染料的两种不同来源）不适合制备β-CD缀合物。市售染料的1 H NMR光谱和TLC分析分别在支持信息文件1，图S1和S2，图S8和S9以及图S41和S42中提供。因此，两种染料都是从荧光素（Flu，1）开始新合成的。尽管所描述的用于制备曙红染料的合成方法通常使用Br 2，但本文使用危害较小的N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）作为溴源。因此，曙红Y（2在NBS存在下，从1中在乙醇中一步制备（图1）。合成的详细描述在支持信息文件1中报告。

EoB（4）的合成分两步进行：首先，通过在乙酸中用NBS 部分溴化1合成二溴荧光素（3）（图1）。然而，在所选择的反应条件下，获得单 - ，二 - 和三溴荧光素的三组分混合物，并且从该原油中分离目标二溴化产物3是非常费力且低产率的。另一方面，当使用略微过量的NBS（相对于1倍过量2.5倍摩尔）时，仅形成二溴和三溴荧光素的双组分混合物。隔离3通过直接相硅胶柱色谱法，用等度氯仿/甲醇洗脱，可以很容易地从这种原油中获得。因此，将过溴化的副产物永久固定在硅胶柱上，仅洗脱目标二溴荧光素（3）。借助于1D和2D NMR实验（支持信息文件1，图S10-S14）阐明化合物3的结构。在下一步骤中，使用标准硝化条件对二溴化荧光素3进行硝化，以获得所需的染料曙红B（4）（图1）。NMR光谱显示游离染料曙红Y（2）和曙红B 的结构解析（图4）分别显示在支持信息文件1，图S3-S7和图S15-S19中。

通过偶联剂DMTMMC1促进反应，其使得能够在温和的反应条件（室温）下在水中有效缀合。由于成功的缩合需要氨基官能团为游离碱形式，因此加入另外的碱性N-甲基吗啉（NMM）。所有反应物都很好地溶于水，产生均匀的反应混合物，并且在两种情况下，偶联在室温下在3小时内进行曙红Y（2）和在曙红B（4）情况下进行12小时。粗反应混合物的TLC分析给出了成功形成共轭物的第一个明确证据，因为形成的产物具有R f价值与其他原料不同。此外，产物在254nm和366nm激发后显示出强烈的吸光度，并且它们是可碳化的。因此，产物表现出荧光CD缀合物的预期特征（图3）。反应的后处理包括反应混合物的浓缩和CD相关化合物（共轭物和未反应的原料）与丙酮的选择性沉淀。由于游离染料，NMM，DMTMM相关产物和其它反应杂质都很好地溶于水/丙酮混合物中，通过用足量的这些溶剂洗涤沉淀物可以容易地除去它们。为了将靶标缀合物与未反应的6-单氨基-β-CD分离（5-10％基于TLC评估，见图3）），使用乙腈（ACN）/ H 2 O / NH 3洗脱混合物对沉淀物进行直相柱色谱，其中较快洗脱的组分是缀合物，较慢的是未反应的氨基环糊精，其最终可以回收。