炔烃修饰的NAD +类似物

首先，通过在腺嘌呤碱基的共同位点引入小的末端炔烃官能团，系统地改变报告基团的位置。成功掺入PAR后，这些炔烃用作铜（I）催化叠氮化物 - 炔烃点击反应（CuAAC）[22]的手柄，用荧光染料。末端炔烃是允许选择性标记聚（ADP-核糖）的最小可能的报告基团[17]。据报道，炔烃修饰的衍生物的合成1 - 4是以前[16,17,23]通过制备从共同的前体各自的炔烃修饰的核苷和把它们变成其相应的NAD完成+两步程序中的类似物（支持信息文件1，方案S1）。

接下来，在ADP-核糖基化测定中研究NAD +底物性质，其中组蛋白H1.2作为受体并且在ARTD自动修饰中。为了更好地比较，选择ARTD2，ARTD5和ARTD6的测定条件是相似的，并且源自先前建立的ARTD1催化的ADP-核糖基化[21]。将NAD +或NAD +类似物与ARTD酶在反应缓冲液中孵育并在有或没有组蛋白H1.2作为额外受体蛋白的情况下在30℃下进行，以降低报道的tankyrases的NADase活性[15]。。反应时间分别延长至1小时，4小时和2小时，以实现显着的PAR形成。此外，没有DNA加入端锚聚合酶反应。值得注意的是，发现ARTD2不被短的八聚体DNA激活，例如在ARTD1的情况下应用，因此加入活化的小牛胸腺DNA以使ARTD2催化PAR产生[24]。在指示的时间之后，进行铜催化的与含荧光团的叠氮化物的点击缀合，并通过SDS PAGE分析反应。然后，检测荧光信号并与考马斯蓝染色的凝胶进行比较（图2）。每种类似物另外在与天然NAD +的1：1混合物中进行测试探索它们对天然底物的竞争力，所有凝胶都含有不含酶的对照。阳性PAR化反应由异质的聚合物修饰的蛋白质和/或由于自身修饰引起的ARTD条带的减少来指示。如果成功掺入类似物，则可以在荧光读数中另外检测聚合物链。

为了更好地比较，还进行了基于ARTD1的ADP-核糖基化测定，因为之前从未测试过所有四种类似物。这些实验的结果总结在表1中。为了说明，图3显示了所有四种测试的ARTD 对衍生物1的处理。值得注意的是，先前已有报道[21]，蛋白质与NAD +类似物的孵育可能导致ADP-核糖与赖氨酸残基形成非酶Schiff碱[25]，可通过对所涉蛋白质进行一些微小染色来检测，这在一些研究的反应中也可见。

正如从ARTD1和ARTD2（图a和b）之间的紧密结构相似性所预期的，两种酶在组蛋白ADP-核糖基化（支持信息文件1，图S1）和自动（ADP- 核糖体）化中表现相似（图S2）。从以前的工作[15,17]可知，ARTD1无法处理7和8修改的NAD 3和4，ARTD2也是如此（支持信息文件1，图S1，通道9到14和图S2，通道7到10）。在两种测定中，只有少量的修饰的PAR与6-修饰的衍生物2形成并且在没有天然NAD +的情况下（支持信息文件1），图S1，泳道7和图S2，泳道5），与2-修饰的类似物1平行比较。然而，在含有NAD +的混合物中检测到强信号（图S1，泳道8和图S2，泳道6）。化合物1的应用产生最强的信号并且对天然底物具有竞争性（图S1，泳道4至5和图S2，泳道3至4）。

同样在ARTD5和ARTD6催化的ADP-核糖基化（图c和d）中，类似物3和4不用作底物（支持信息文件1，图S1，泳道9至10和图S2，泳道7至10）。相反，即使在不存在天然NAD +的情况下，化合物1和2也被两种酶用于PAR形成。在ARTD5的情况下，衍生物1在组蛋白ADP-核糖基化中似乎比2更好地加工，而在ARTD6的情况下，两者在两种测定中都用作具有相似效率的底物。