“可点击”尿苷及其荧光标记和DNA成像应用

合成阿拉伯糖配位的尿苷类似物，其在2'位具有炔丙基，并通过固相化学法掺入DNA中。由蓝色和绿色发光的花青 - 苯乙烯基染料进行后合成修饰的DNA链的荧光量子产率由于阿拉伯配置的锚而得到改善。这些寡核苷酸用作杂交体中的能量转移供体，其中寡核苷酸用在黄红色范围内发射的受体染料修饰。这些组合使能量转移对具有蓝 - 黄，蓝 - 红和绿 - 红发射颜色变化。评估了阿拉伯 - 和核 - 构型的供体链与阿拉伯糖和核糖构型的受体链的所有组合。通过它们的发射颜色对比和荧光量子产率筛选这一双重修饰的杂种阵列。特别是混合组合，这意味着具有阿拉伯配置的锚的供体染料与具有核配置锚的受体染料，反之亦然，显示出显着改善的荧光性质。这些成功应用于运输到活细胞后的DNA荧光成像。

关键词： 染料; 荧光; 核酸; 寡核苷酸

“点击”型反应[1]，特别是炔烃和叠氮化物（CuAAC）之间的1,3-偶极环加成反应是广泛应用于合成后寡核苷酸修饰的策略，因为两种反应基团都不存在于核酸中[2-5] ]。尽管Huisgen描述了20世纪60年代已经产生1,2,3-三唑的非催化反应[6]，但在Sharpless [7]和Meldal [8]报道Cu（I催化）后，蛋白质和核酸的生物正交性出现了。）不仅提高了反应速率，而且提高了区域选择性。通过使用螯合Cu（I）配体，特别是三[（1-苄基-1），避免了Cu（I）形成寡核苷酸氧化副产物。H -1,2,3-三唑-4-基）甲基]胺（TBTA）和更好的水溶性衍生物[9,10]。CuAAC不仅可用于溶液中的常规合成后寡核苷酸修饰，还可用于固相[11]和多种后合成修饰的引入[12]。CuAAC的叠氮基通常置于荧光染料上，因为叠氮化物与亚磷酰胺化学不相容。作为反应前体的炔基与寡核苷酸[13]连接，特别是在嘧啶[13]的5-位，7-脱氮嘌呤的7-位[14]和呋喃核糖苷的2'-位[11]， 15]。选择这些位置是因为它们通常在引物延伸实验和PCR中被DNA聚合酶所接受[4,16]。

为了开发经历能量转移反应的荧光标记的寡核苷酸[17]，我们最近应用2'-炔丙基修饰的尿苷1作为DNA构建块（方案1）[15,18,19]。对双螺旋DNA的三维结构的简单观察阐明，通过在锚核苷糖的2'位置反转构型，可以改善荧光团在大沟中的定位。事实上，阿拉伯核酸是一类重要的反义寡核苷酸[20]，因为他们的第一份报告[21]。阿拉伯构型中的2'-OH基团朝向主沟的取向产生具有RNA的杂交体，与DNA / RNA杂交体相比，其显示出略低的热稳定性。为了评估我们荧光标记的寡核苷酸的这种结构影响，我们开发并合成了2'-炔丙基修饰的阿拉伯配置的尿苷类似物2，通过自动亚磷酰胺化学将其掺入DNA中，“点击”它到我们最近的各种建立了光稳定的花青 - 苯乙烯基染料，并通过测定量子产率和发光颜色对比来探测荧光和能量转移性质。

亚磷酰胺7的合成（方案2）是直接的并且主要包括保护基团化学，因为它开始于市售的阿拉伯糖配位的尿苷类似物3。核苷3的3'-和5'-羟基官能团被Markiewicz甲硅烷基醚选择性地保护[22]。整个合成方法的中心步骤是通过炔丙基溴化物对核苷4的2'-OH官能团进行烷基化，其在NaH作为碱的存在下以65％的产率进行。从核苷除去甲硅烷基保护基后5，核苷的5'-位2再次用4,4'-二甲氧基三苯甲基氯（DMTr-Cl）保护，最后，核苷6的3'-位被亚磷酸化。值得注意的是，在所述五个步骤中具有优化条件的亚磷酰胺7的总收率为54％。使用7作为构建块的自动DNA合成需要稍微延长的10分钟的偶联时间。用于“可点击的”核苷1的亚磷酰胺是可商购的。制备后，将脱三苯甲基化的寡核苷酸DNA1a（“a”=阿拉伯糖）和DNA1r（“r”=核糖）从树脂上切下并用浓盐酸脱保护。NH 4OH在45°C下保持16小时。如上所述，在Cu（I）和TBTA存在下，冻干的寡核苷酸与叠氮化物修饰的染料D1 - D4反应。反应在H 2 O / DMSO / t- BuOH 3：3：1中进行，并在60℃下1.5小时后完成。在EDTA存在下通过乙醇沉淀纯化修饰的寡核苷酸以除去铜离子，随后通过半制备HPLC纯化。