用于肿瘤靶向的RGD和isoDGR拟肽-α-鹅膏毒素结合物的合成

通过各种接头和间隔基将整联蛋白配体连接到α-鹅膏毒素来合成RGD-α-鹅膏毒素和isoDGR-α-鹅膏毒素缀合物。缀合物针对其抑制生物素化的玻连蛋白结合到纯化的α能力进行了评价V β 3受体，保持良好的结合亲和力，在相同的纳摩尔范围内的游离配体。缀合物的抗增殖活性在三种细胞系中评价具有不同水平的α的V β 3整联蛋白表达：人恶性胶质瘤U87（α V β 3 +），人肺癌A549（α V β 3 - ）和乳腺癌MDA- MB-468（α V β 3- ）。在U87中，在MDA-MB-468中，部分在A549癌细胞系中，发现携带溶酶体可切割的Val-Ala接头的环[DKP-isoDGR]-α-鹅膏毒素缀合物比α更有效。 -amanitin。显然，所有这些α鹅膏蕈碱缀合物有细胞毒性和α的表达之间没有相关性V β 3整联蛋白。为了确定环的增加的细胞毒性[DKP-isoDGR]-α鹅膏蕈碱缀合物是由整联蛋白介导的结合和内化的过程约束，竞争实验中进行，其中缀合物用U87（α测试V β 3 + ，α V β 5 +，α V β 6 - ，α5 β 1+）和MDA-MB-468（α V β 3 - ，α V β 5 +，α V β 6 +，α 5 β 1 - ）细胞中过量西仑吉肽的存在下，用封闭整合的目的在细胞表面。使用MDA-MB-468细胞系中，IC的增加了五倍50观察到缀合物过量西仑吉肽，这是已知的强烈结合不仅α的存在V β 3，而且α V β 5，α V β 6，α 5 β 1。这些数据表明，在这种情况下，环[DKP-isoDGR]-α鹅膏蕈碱缀合物可能通过从α不同整联介导的内化过程V β 3（例如，α V β 5）。

关键词： 抗肿瘤药; 癌症; 药物输送; 整合; 肽

α-Amanitin是一种属于amatoxin科的双环八肽毒素，见于Amanita Phalloides（死亡帽蘑菇），见图1 [1]。其作用机制在于通过有效阻断RNA聚合酶II来抑制细胞转录，RNA聚合酶II存在于真核细胞的细胞核中，并负责将DNA转录为mRNA [1,2]。尽管有这种强烈的抑制活性，但α-amanitin在大多数哺乳动物细胞中仅表现出微摩尔细胞毒性和低细胞摄取，这是由于其极性强和膜通透性差[2]。一个值得注意的例外是人肝细胞，其中转运蛋白OATP1B3内化了amatoxins，导致高肝毒性[2,3]。

在存在允许细胞渗透的内吞作用介质存在下的这种强毒性引起了对使用α-鹅膏毒素作为靶向癌症治疗的有效负载的兴趣。1981年，Davis和Preston报道了抗体 - 药物偶联物（ADC）α-amanitin-anti-Thy 1.2 IgG的合成，其毒性比未结合的α-amanitin在鼠T淋巴瘤S49.1细胞中毒性高47倍。线[4]。2012年，Moldenhauer及其同事[5]制备了一种含有α-鹅膏毒素和嵌合抗EpCAM（上皮细胞粘附分子）单克隆抗体的新型ADC 。在EpCAM过表达的癌细胞系中测试该缀合物的细胞毒性，获得2.5×10 -10至2.0×10 -12的 IC 50值。M.在携带BxPc-3胰腺异种移植肿瘤的小鼠中也观察到有希望的结果，在以100μg/ kg的剂量注射α-amanitin-抗-EpCAM ADC两次后，90％的病例完全肿瘤消退。对α-amanitin。在这两个实施例中，单克隆抗体的内化和随后的毒素释放导致靶细胞上α-鹅膏毒素活性的增强。

抗体靶向治疗的另一种方法是小分子 - 药物偶联物（SMDCs），其中小分子 - 通常是肽或肽模拟受体配体 - 避免了ADC的缺点，例如高制造成本，不利的药代动力学（低组织扩散）和低积累率）和免疫反应的可能诱发[6]。通过与特定细胞膜 - 受体配体缀合，毒素可以在肿瘤部位递送并通过受体介导的内吞作用内化。2013年，Reshetnyak及其同事通过不同疏水性的接头将α-amanitin与pHLIP（pH低插入肽）偶联[7]。结果表明，pHLIP可以将α-amanitin递送到细胞中，并通过pH介导的跨膜转运和细胞质中二硫键连接的切割在48小时内诱导细胞死亡。在另一个实例中，Perrin及其同事使用铜催化的叠氮化物 - 炔烃环加成[8]将amanitin类似物的N-丙基伞嘌呤与环RGD整联蛋白配体（环[RGDfK]）偶联。在U87胶质母细胞瘤细胞系中测试缀合物，但仅观察到与α-amanitin相比毒性略有增强。

跨膜受体α V β 3整联对几种人类癌症中的血管（例如，乳腺癌，胶质母细胞瘤，胰腺肿瘤，前列腺癌），但不是对健康组织的脉管系统中广泛表达[9-11] ，并因此在SMDC领域中构成合适的治疗靶标。整合素α V β 3由三肽精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸识别内源性配体[12]（RGD）和也由相关序列异天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸（isoDGR）[13-20] 。已经制备了许多含有这些序列的合成肽或肽模拟物，并显示出低纳摩尔IC 50对于整合素α值V β 3结合[21-27] 。在过去十年中，Gennari和Piarulli组已经开发了许多含有双功能二酮哌嗪（DKP）支架的环状RGD和isoDGR配体[24-27]。其中，环[DKP-RGD] 1 [25]和环[DKP-isoDGR] 3 [26] （图2）显示出对纯化的受体α的结合亲和力V β 3在低纳摩尔范围和良好的选择性此整合与整合素α比较V β 5（33-34倍，见表1）。