荧光PNA探针 - 化学试剂定制合成网

在与特定生物分子靶标（包括核酸以及非核酸靶标，例如蛋白质和小分子）结合时可以产生荧光信号变化的荧光寡核苷酸探针在各种重要领域中具有应用。这些包括诊断，药物开发和作为原位和实时研究生物分子相互作用的工具。探针通常由标记的寡核苷酸链作为识别元件和信号转导机制组成，其可以将结合事件转化为可测量的信号。虽然已经开发了许多用于信号转导的策略，但是对识别元件的关注相对较少。肽核酸（PNA）是具有几种有利特性的DNA模拟物，使其成为荧光探针开发的天然核酸的潜在替代品，包括它们非常强大和特异性的识别以及优异的化学和生物稳定性以及它们结合的能力。结构化核酸靶标。此外，PNA的不带电骨架允许其他独特的设计不能用寡核苷酸或具有带负电荷的骨架的类似物进行。本综述旨在介绍该原理，展示最先进的技术，并更新过去20年来荧光PNA探针领域的最新进展。包括它们非常强的和特异性的识别以及优异的化学和生物稳定性，以及它们结合结构化核酸靶标的能力。此外，PNA的不带电骨架允许其他独特的设计不能用寡核苷酸或具有带负电荷的骨架的类似物进行。本综述旨在介绍该原理，展示最先进的技术，并更新过去20年来荧光PNA探针领域的最新进展。包括它们非常强的和特异性的识别以及优异的化学和生物稳定性，以及它们结合结构化核酸靶标的能力。此外，PNA的不带电骨架允许其他独特的设计不能用寡核苷酸或具有带负电荷的骨架的类似物进行。本综述旨在介绍该原理，展示最先进的技术，并更新过去20年来荧光PNA探针领域的最新进展。

关键词： DNA; 荧光; 分子信标; 分子探针; oligonucelotides; RNA

可以高灵敏度和准确度检测和定量特定生物分子的分子探针的开发，优选原位和实时，是一个重要的研究领域，因为它有助于提高对复杂生物分子系统的理解，并且在不同领域的实际应用，包括临床诊断和药物发现等。分子探针通常由可以与特定靶标结合的识别元件和与适当的信号转导机制组合的分子相互作用转化为可测量信号的报道基团组成。在几种可用的检测模式中，荧光检测具有许多独特的优点，但主要是它相对简单，有选择性，高度敏感，可用于生物靶标的实时监测，甚至可用于体内相互作用。对于核酸，尽管近年来该领域取得了巨大进步，但通过测序无法获得后者有价值的信息[1]。

因此，荧光寡核苷酸探针仍然是最重要的工具之一，不仅用于检测核酸，而且还通过采用适体技术检测蛋白质和其他非核酸靶标[2]。然而，普通荧光寡核苷酸探针通常在游离和靶限状态之间显示出难以区分的信号。这意味着需要额外的处理以分离结合和未结合的探针，这通常通过固相杂交实现，然后在执行荧光读数之前洗涤以消除未结合的探针。这些测定需要多个步骤，因此耗时，使得它们不适合于实时监测，例如核酸扩增，酶活性的监测和活细胞中核酸的定位和定量。因此，非常希望开发一种“智能”荧光寡核苷酸探针，其可以通过简单的荧光读数以均匀和无洗涤的形式直接报告靶标的存在。图1）[3,4]。

[1860-5397-14-17-1]

图1：经典DNA分子信标的设计。

虽然已经开发了许多信号转导和读出策略，即使仅基于荧光的检测，探针的识别元件几乎总是寡脱氧核苷酸。在过去的几十年中，不断发展的非天然寡核苷酸具有优异的性质，使其成为传统上使用的寡脱氧核苷酸探针的有价值的替代品。在这方面，肽核酸（PNA）[5]除锁定和吗啉代核酸外，还是最广泛使用的替代寡核苷酸探针之一[6,7]。尽管存在许多关于荧光寡核苷酸探针的综述文章[8-17]，但很少有专门处理荧光非天然寡核苷酸探针的文章。[18,19]。本综述旨在通过介绍原理，展示最先进的技术和更新荧光PNA探针领域的最新发展来填补这一空白。在认为合适的情况下，已经包括用于核酸杂交和检测的PNA探针的一些实例，其可以不是严格的荧光定义。

PNA和荧光PNA探针概述

肽核酸（PNA）是一类独特的寡核苷酸模拟物，由肽样骨架组成。尽管自20世纪70年代以来，用完全不相关的支架如肽取代DNA的全糖 - 磷酸骨架的想法已经存在[20]，但直到20世纪90年代才出现了第一个带有N -2-氨基乙基甘氨酸的 PNA系统（据报道，能够识别其靶DNA和RNA的骨架[21]。考虑到两个骨架之间的巨大差异，根据Watson-Crick碱基配对规则，PNA仍能保留识别具有高亲和力和特异性的互补序列的天然寡核苷酸的能力，这是非常令人惊讶的[22]。。事实上，与天然寡核苷酸相比，PNA在互补和错配的核酸靶标之间表现出更高的亲和力和更好的区分。此外，PNA的不带电荷的肽样骨架有助于在具有带负电荷的磷酸基团的其他种类的寡核苷酸类似物中未观察到的几种独特性质。这些包括PNA-DNA或PNA-RNA杂交体对溶剂离子强度的相对不敏感性[23]，以及对核酸酶和蛋白酶的完全稳定性[24]。

总的来说，这些特性使得PNA可用于多种应用，包括治疗和诊断[25]，以及作为DNA操作的独特工具，如PCR钳[26]和PNA开放[27]。具有讽刺意味的是，作为几种上述优点的基础的PNA的完全相同的不带电性质带来了新的挑战，包括差的水溶性和非特异性结合到疏水表面的趋势，包括其他PNA分子以形成聚集体。这些可以在很大程度上通过PNA与带电或亲水基团的结合或通过骨架修饰来克服[28]。PNA结构的简单性为设计具有改进的溶解度和其他性质的新PNA系统提供了无限的可能性，并将新功能纳入PNA分子[29]。基于aeg骨架的原始PNA系统的一些值得注意的性能改进已经通过在合适的位置（例如在γPNA中）掺入合适的取代基来约束构象灵活性[30]，或通过将环状结构结合到PNA骨架中来实现。（例如在acpcPNA中，图2）[31,32]。

[1860-5397-14-17-2]

图2： DNA和选定的PNA系统的结构。

PNA对其各自的核酸靶标的高结合亲和力和优异的特异性立即表明它们可能用作诊断探针。此外，PNA探针的优点还包括广泛的耐盐性和对大多数酶的稳定性。此外，PNA结合双链（ds）DNA（图3）[33]，dsRNA [34]和其他不寻常结构（如G-四链体[35]）的能力使PNA成为靶向结构的理想工具。核酸靶标。简单的荧光标记的PNA探针已经在核酸检测和定量中发现了广泛的应用。已成功使用PNA探针的此类测定的实例包括阵列杂交[36,37]通过荧光原位杂交（FISH）染色细胞内核酸[38,39]。由于在寡核苷酸探针的情况下上面解释的相同原因，更期望开发荧光PNA探针，其可响应于与其特定靶标的杂交而改变其荧光信号。最明显的策略是使用与DNA信标相同的原理，其中两个相互作用的染料被放置在形成发夹的PNA探针上，该探针可以在靶杂交时切换到开放构象[3,4]。

[1860-5397-14-17-3]

图3： PNA与双链DNA的各种结合模式，包括三链体形成，三链体入侵，双链体侵入和双链体入侵

据报道，与线性DNA信标相比，短的线性PNA信标可以表现得非常好[40]。。这可归因于PNA在水性介质中形成紧密结构的能力，从而迫使两种染料紧密接触，以及PNA的优异的错配识别能力。最初为荧光寡核苷酸探针开发的几种其他策略也已成功应用于PNA探针。这些包括二元探针和核酸模板化反应，链置换探针和普通PNA探针与纳米材料作为外部猝灭剂的组合。此外，PNA的不带电骨架提供其他独特设计，包括PNA探针与阳离子共轭聚合物的组合，同时充当光捕获天线和荧光共振能量转移（FRET）合作伙伴，以及短线性PNA探针与环境敏感染料，

PNA探针在同一链中携带两种或更多种相互作用的染料

这种类型的第一个PNA探针在1998年由Ortiz等人独立报道。[41]和Armitage等人。[42]。这些第一代PNA信标采用与经典DNA信标类似的设计原理，具有携带荧光团的发夹结构和附着于茎部分的猝灭剂。在正常状态下，采用的发夹结构迫使荧光染料和猝灭剂紧密接近，导致染料猝灭。与互补DNA靶标结合打开发夹结构并恢复荧光。在Armitage的设计[42]中，整个灯塔纯粹是PNA，而在Ortiz设计中[41]，PNA用作DNA结合结构域，茎部分由通过二硫键连接在一起的嵌合PNA-DNA杂合体组成（图4）。通过生物素标签将嵌合信标固定在微量滴定板上，并用于检测来自溶组织内阿米巴 的rDNA扩增子[41]。PNA的使用允许在简单变性后直接检测双链（ds）DNA靶标，这是由于PNA能够更强地与DNA结合并因此有效地与DNA重新结合竞争。

[1860-5397-14-17-4] — 图4：根据（A）Ortiz等人的PNA信标的设计和工作原理。[41]和（B）Armitage等。[42]。DNA结合结构域以红色显示。