偏振光谱法测定小分子与核酸的相互作用

核酸与小分子（配体）之间非共价复合物的结构表征对生物有机物研究具有重要意义。关于核酸/配体复合物（例如单晶X射线衍射或NMR光谱）的高度信息性方法不能在生物相容的条件下进行并且非常耗时。因此，为了寻找可以应用于至少类似于天然存在的条件的更快的方法，一组偏振光谱方法已经显示出非常有希望的结果。电子圆二色性（ECD）是表征DNA和RNA的螺旋结构及其与配体的复合物的最常用方法。不太常见但与ECD互补的是流向线性二向色性（LD）。其他方法如振动CD（VCD）和基于发射的方法（FDCD，CPL）也可用于合适的样品。尽管极化光谱学在生物物理学中很受欢迎，但除了对这些方法应用于DNA / RNA研究的几个高度集中的评论之外，没有系统的教程涵盖所有提到的方法作为表征核酸和小配体之间的加合物的工具。本教程旨在帮助研究人员进入研究领域，准确地组织实验并可靠地解释获得的数据。没有系统的教程涵盖所有提到的方法作为表征核酸和小配体之间的加合物的工具。本教程旨在帮助研究人员进入研究领域，准确地组织实验并可靠地解释获得的数据。没有系统的教程涵盖所有提到的方法作为表征核酸和小配体之间的加合物的工具。本教程旨在帮助研究人员进入研究领域，准确地组织实验并可靠地解释获得的数据。

关键词： 圆二色性; 基于发射的二色性; 沟槽绑定; 插层; 线性二向色性; 非共价相互作用; 核酸识别; 振动圆二色性

许多生物分子是手性和发色的，其中最重要的例子包括蛋白质和核酸。此外，天然生物聚合物的手性成分是纯手性的，例如（几乎）仅有L-氨基酸，并且发现了D-糖。在其他性质中，手性发色分子与右旋圆偏振光（R-CP光）不同地吸收左旋圆偏振光（L-CP光）。L-CP和R-CP光可以看作是两个分量，在平面偏振光（PP，图1）的相反方向（逆时针与顺时针）旋转。因此，圆偏振光的使用导致了用于研究手性非外消旋分子的几种光谱方法的发展，包括生物聚合物[1-4]。在生物大分子的结构研究中发现了这些方法的特别重要的应用[3]。例如，电子圆二色性（ECD）是最常用的方法，在蛋白质的结构研究中是必不可少的，并且也被广泛用于表征DNA和RNA的螺旋结构[5]。。由于核酸的特征在于显性螺旋手性并且表现出相当小的二级结构组，每个二级结构的特征在于不同的偏振光谱特征，它们是监测外部刺激诱导的结构变化的便利目标。线性二向色性（LD）是另一种类型的偏振光谱，其不需要手性样品而是需要定向样品。它基于平行或垂直于某个取向轴偏振的光的差分吸收。这也适用于生物大分子，如核酸，其螺旋通常在单一方向上伸长[2]。在这种情况下，最常见的方法之一是在配体与DNA或RNA结合后监测ECD或LD谱的变化。[6]。

图1： 平面偏振光（PP，青色）作为左右圆偏振光（L-CP，红色和R-CP，黄色）的总和。L-CP被定义为远离源的观察者（在图的右侧）将看到描述逆时针圆的矢量。

小分子（配体）与DNA和RNA的非共价相互作用是最重要的，因为许多生物过程，药物和生化工具/探针依赖于它们[7,8]。由于在小分子配体和大受体（DNA / RNA）之间形成的复合物可能具有多面性，因此需要几种互补方法来准确表征它们的相互作用。尽管用于DNA /配体相互作用研究的实验的设计和性能对于此处描述的各种技术（以及标准UV-vis，IR或荧光光谱）是常见的，但是与方法的灵敏度有关的几个重要差异，可能的人工制品和获得结果的解释。由于一些重要事实经常被忽略，所获得的结果可能无法提供可靠的信息或被误解。

希望详细描述实验条件和结果解释的一般规则将导致更广泛的应用和更高的结果准确性，过去曾写过几篇评论和教程。例如，一篇专注于圆二色性作为研究非共价配体/ DNA相互作用的工具的教程[9]，为测量提供了逐步的协议。最近，为LD实验发表了类似的教程[10]，并且在更加比较的基础上总结了关于如何解释关于最常见配体/ DNA结合模式的CD和LD结果的概述[6]。在过去的几十年中，还开发了ECD的补充方法，例如，振动CD（VCD）成功应用于研究DNA /配体相互作用[11]。此外，荧光检测圆二色性（FDCD）结合了CD和荧光发射技术的优点，这是选择性研究结合后强烈改变荧光的DNA配体的理想选择[3]。在与FDCD互补的意义上，圆偏振发光（CPL）也是一种手性发射技术，最近在相同的背景下首次应用[12]。

本综述的目的是在一个教程中总结所有必需的信息和实践建议，用于使用最常见的偏振光谱方法进行实验：ECD，LD，VCD，FDCD和CPL，目的是准确测定小分子与小分子的相互作用。核酸。在所讨论的方法中，主要关注的焦点是最常用的技术，ECD和LD。此外，我们将详细阐述结果的解释，不仅对于最常见的DNA，RNA /配体结合模式（插入，沟结合），而且对于越来越多的配体聚集体与多核苷酸结合（图2））。许多天然存在的小分子由于聚集而具有不同的生物活性，例如，亲近的类似物netropsin（DNA小沟中的单分子）和distamycin（DNA小沟中的二聚体）[13]。此外，我们将讨论结果计算分析的最新可能性，作为目前使用的经验规则[6]的外展，用于确定配体结合模式。

ECD和LD基于电磁波谱的UV-vis范围内的一个或多个发色团的光吸收现象，其中发生电子跃迁。这些偏振光谱法用于研究小分子（配体）与DNA或RNA之间的复合物的应用通常可分为两个波长范围：

a）监测DNA和RNA吸收光（λ= 200-300nm）的波长范围内的变化，从而具有固有光谱。DNA或RNA的固有光谱特性的变化通常可以与多核苷酸二级结构的特定变化相关联（参见第2.1章）。然而，如果配体的发色团也在此范围内吸收，则所有贡献的反卷积并非微不足道（参见相应方法章节中结果的解释）;

b）监测具有相应发色团的配体在λ> 300nm处的偏振光谱的变化。这是最常用的方法，因为它监测复杂形成中涉及的仅一个物种的变化，因此结果的解释简单明了。

然而，为了准确地设计偏振光谱实验，必须充分制备和表征多核苷酸和配体的溶液。因此，第2.2和2.3章总结了样品制备中最重要问题的简短描述。

2.1。DNA或RNA二级结构与极化光谱的关系

核碱基是非手性的，但核苷和核苷酸衍生物是光学活性的。碱基的π→π*跃迁（方案1）有助于电子圆二色性，这主要是由糖部分产生的手性扰动的结果。因此，单核苷/核苷酸的ECD信号非常小。偶联到多核苷酸中，特别是在DNA或RNA的双链螺旋中，引入螺旋手性，其中螺旋轴几乎垂直于芳香碱基对平面。在这种情况下，由于在规则排列的发色团的各种π→π*跃迁之间的所谓耦合振荡器或激子耦合机制，ECD发生显着变化[14]（图3，上图）。