今天跟大家分享一篇近期发表在Angew.Chem. Int. Ed. 的文章，题目是SelectiveTriazenation Reaction (STaR) of Seconary Amines for Tagging Monomethyl LysinePTMs。本文通讯作者是奥本大学化学与生物化学系MonikaRaj教授，她们课题组对利用有机化学工具来解决生物学领域的问题感兴趣，并引导发展新的化学反应、催化和连接方法来合成生物分子。赖氨酸甲基化是蛋白质最重要的翻译后修饰（PTM）之一，因为它调节各种生物过程，包括细胞生长、分裂、基因表达和DNA/ RNA结合。由于赖氨酸的独特结构，它能进行单、二和三甲基化反应，不同水平的甲基化反应会在细胞内产生不同的功能和定位。单甲基化赖氨酸（Kme）PTM不仅与转录激活和沉默有关，而且异常的PTM也与心脏病，癌症和糖尿病等疾病有关。与其他PTM相比，赖氨酸的单甲基化不会增加蛋白质的含量，不会中和其正电荷，也不会显着改变其疏水性（图1a）。此外，甲基太小而无法被特异性抗体捕获，因此很难开发出高效的富集策略。在本文中作者报道了一种方法，称为选择性三叠氮化反应“STaR”，该方法允许从复杂混合物中进行化学选择性Kme标记和富集，然后在温和条件下以“无痕”方式解偶联。由于STaR所需的试剂体积小，该策略非常适合泛特异性。

图1  STaR选择性三叠氮化反应

芳烃重氮离子能够与伯胺形成三氮烯，但由于其可逆性而从未被用作生物偶联方法（图1b）。芳烃重氮离子与酪氨酸的偶氮偶联需要亲电性更强芳烃重氮离子才能在生理条件下（pH7.4）进行反应（图1b）。此外，据报道，在生理条件下（pH7.5），富含电子的重氮离子与Cys的反应收率低。受此启发，作者认为，带有供电子取代基芳烃重氮离子可能应用于仲胺新型化学选择性反应。（图1c）

作者首先利用4甲氧基苯重氮离子（4MDz）与单甲基赖氨酸、酪基酸之间的反应来评估仲胺对亲电性较低的芳烃重氮离子的反应性（图2a），HPLC结果表明，在短短5分钟三氮烯偶联加合物的转化率为93％，而4MDz与酪氨酸之间的反应即使在24小时后，也未观察到偶氮偶联产物（图2b）。

图2 在生理条件下仲胺相对于酪氨酸对富电子芳基重氮离子4MDz的高反应性

接下来作者通过4MDz和另一种重氮离子4-羧基苯重氮4CDz与不同大小的各种肽和在不同位置含有单甲基化赖氨酸的氨基酸组成的反应来证明STaR的泛特异性。为了确定STaR在复杂环境中的高选择性，用4MDz处理了肽PAF、AKmeF、GAKmeF和GKmeAKmeF的混合物，并通过LC-MS分析了所得溶液（图3），观察到所有肽的完整标记。这些实验证明从单个肽到复杂混合物的STaR的高选择性。

图3  在生理条件下STaR在复杂环境中的高选择性

接着作者设计了一个炔基功能化的芳基重氮离子(ABDz)，并在不同肽段如GAKmeF、 AKmeF、 GGKmeGKF、GKmeAKmeF 和 Kme2GGKmeGKF中对其化学选择性进行了验证（图4a），ABDz也能够实现与Kme反应的选择性，并且在复杂的肽段体系中也同样具有选择性（图4b）。之后，作者对4MDz标记的稳定性进行了检测（图4c），并通过实验证明了这种标记在10%TFA中能够在5分钟内实现快速断裂（图4d）。最后，作者利用含有叠氮的树脂对ABDz标记的肽段进行了富集，验证了含二级胺的肽段都能够被富集。

图4  炔功能化芳烃重氮化化学选择性富集仲胺多肽

总之，STaR提供了一种新颖的一步式仲胺选择性标记、捕获和释放策略，用于富集和鉴定复杂混合物中的单甲基赖氨酸蛋白水解片段。