非常规检测手段(萃取、衍生化)的理论与应用

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摘要

分析方法开发过程中会遇到一些特殊情况,如主成分降解干扰测定、杂质无吸收等,给分析工作带来极大的挑战,本文从萃取检测、衍生化检测两个方面结合实际案例进行介绍,提供一个解决问题的思路,不足和缺陷之处望同行批评指正。



一、萃取技术介绍及实施例


溶剂萃取有多种形式,瓶振摇法,向样品中加入溶剂并振摇,当被测物在提取溶剂中的溶解度很大且样品孔多时,这一工作很容易。对于快速萃取来说,应将样品研磨分散,超声或加热提取,使提取效率最大化,通常提取效率不得低于80%。


实际应用—头孢噻肟中冰醋酸测定案例


头孢噻肟钠本身在顶空平衡过程中也可能分解产生乙酸,造成测定结果过高,无法真实反映样品中乙酸的残留量,采用环己烷作为溶剂进行固液萃取,因为头孢噻肟钠不溶于环己烷,而乙酸可溶于环己烷,涡旋混合器振动后,头孢噻肟钠中的乙酸就游离至环己烷中,过滤掉头孢噻肟钠粉末,即可检测滤液中的乙酸。

二、衍生化技术介绍及实施例


在液相色谱法中,紫外吸收检测器是最常见的一种高灵敏度检测器。但是有很多化合物在紫外可见光谱区没有吸收,而不能被检测。将它们与带有紫外吸收基团的衍生试剂在一定条件下发生反应,由于反应产物带有发色基团而能被检测。


1、   胺类化合物的衍生化


胺的化学性质与其氮原子上有两个未成对的电子有关。胺具有亲核性,易与亲电性的化合物发生反应,即容易与卤代烃、羰基化合物、酰基化合物、酸等发生反应,因此它们常用作胺类化合物的衍生试剂。


(1)      卤代烃衍生化试剂  2,4-二硝基氟苯(FDNB)的对位、邻位上硝基的存在使炉卤原子更加活泼,容易发生反应。这种试剂主要与仲胺发生衍生化反应,因此常用于仲胺的鉴别。


(2)      酰氯类衍生化试剂  苯甲酰氯及其衍生物对硝基苯甲酰氯、3,5-二硝基苯甲酰氯和对甲(氧)基苯甲酰氯可以与胺类、醇类和酚类化合物反应生成强紫外吸收的苯甲酸酯类衍生物。典型的反应如下:


对硝基苯甲酰氯适用于伯胺的衍生化反应。一种双胍化合物能同对硝基苯甲酰氯生成适合紫外检测的S-三氮杂苯环衍生物。


对甲基苯磺酰氯的衍生反应为

(3)      N-琥珀酰亚胺对硝基苯乙酸酯  该试剂与仲胺反应生成对硝基苯乙酰胺。


2、   α-氨基酸的衍生化


(1)      异硫氰酸苯酯(PITC)  与氨基酸生成苯基乙内酰硫脲衍生物,即PTH-氨基酸。PTH氨基酸在酸性条件下是稳定的,故用作蛋白质酸解时测N-末端氨基酸,对于多肽的序列测定十分有用。PTH氨基酸可借助吸附或反相分配色谱分离,紫外260nm检测限量可达5×10-11mol。PITC与伯胺或仲胺氨基酸反应,反应方程式如下:


实验操作是将氨基酸溶于含60%吡啶及适量异硫氰酸苯酯的水溶液中,并在40℃微热1h,即生成PTH氨基酸。然后在反相ODS柱上,或正相硅胶柱上分离。因为整个反应过程比较长,用该衍生试剂时,一般都采用柱前衍生的方式。


(2)      茚三酮  茚三酮是常用的定量测定氨基酸的柱后衍生试剂。经色谱柱分离后的氨基酸在130℃时与茚三酮反应。伯胺氨基酸的衍生产物在570nm处都有最大吸收,所以利用紫外检测。同样也可以检测蛋白质和多肽等化合物。


另外,仲胺氨基酸如脯氨酸及羟基氨基酸生成的衍生产物的最大吸收在440nm。


3、   羧酸的衍生化


羧酸很容易同酰溴基反应生成酯。衍生试剂有苯甲酰溴、对硝基苯甲酰溴、对氧基苯甲酰溴和对溴苯甲酰溴等。羧酸的衍生化条件与一般酸的酯化有些不同,可以先将欲衍生的酸制成它的钾盐,然后以冠醚为催化剂,钾离子进入冠醚结构内,在冠醚外边的RCOO-基与卤代烃反应,这样形成的酯的产率在90%以上。酯化反应在极性有机溶剂(乙腈、内酮或四氢呋喃)中进行,还可加入三乙胺、N,N-二异丙基胺等催化剂。该衍生化法应用于测定脂肪酸、前列腺素、青霉素和二丙基醋酸等。

1-萘重氮甲烷与C10与C18脂肪酸和某些极性、非极性胆汁酸反应,衍生物在紫外250~280nm范围内检测,可用吸附色谱法分离。

4、   羟基的衍生化


由于酰氯的化学性质很活泼,容易与亲核试剂发生反应,它不仅是胺类化合物的衍生试剂,同时也是羟基化合物的衍生试剂。常用的衍生试剂有3,5-二硝基甲酰氯、对甲氧基苯甲酰氯。

过量的试剂通过水解很容易除去,反应产物用有机溶剂提取,然后直接进样,吸附或反相分配色谱分析。这些衍生物的紫外吸收值与苯环上的取代基及其所处位置有关。对于多羟基化合物,可接上多个苯甲酸基团,其紫外吸收值的大小正比于衍生反应接上的苯甲酸基团的树木。例如,脱乙酰洋地黄苷C可以接上8个对硝基苯甲酸基团,紫外吸收值高达1.2×105。


5、   羰基的衍生化


醛类和酮类化合物与2,4-二硝基苯肼(DNPH)生成苯腙衍生物,反应在弱酸性条件下进行。

该反应速度快而且反应完全,灵敏度高。甾酮、酮酸以及其它羰基化合物都可用此法反应。对硝基苄基羟胺(PNBA)与醛类、酮类反应生成紫外吸收的衍生物肟,反应需要碱催化。

上述两类反应正好互相补充,如有的化合物在酸性条件下不稳定,可用PNBA反应;反之若在碱性条件下不稳定,则可与DNPH反应。例如前列腺素和凝血噁烷先用重氮甲烷处理变成甲酯,再用PNBA反应生成对硝基苄基肟,在紫外254nm处有强吸收。


6、   金属离子的柱后衍生反应


由于大多数无机金属离子在紫外光谱区吸收弱,且无机离子与电解质缓冲液之间折射率的差异不很显著,直接光度或示差折光检测法很少用。虽然电化学检测选择性较高,但只适用于个别的无机离子。因此发展起来了柱后衍生-紫外吸收检测法,该法特别适合于高价金属离子-过渡金属离子和镧系金属离子等的检测。


最常用的金属离子衍生试剂是4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚(PAR),它能与34种金属离子起反应。将1mmol的PAR溶解在pH值较高的缓冲溶液中(如NH2-NH4Ac),PAR可以与大多数过渡金属离子(包括镧系)形成络合物,在520nm处检测。


此外,还有其他一些金属离子的检测:4,5-二羟基-间苯二磺酸衍生测定铝离子;1,5-二苯基碳酰肼衍生测定铬(Ⅵ)离子;铝酸盐衍生测定硅酸盐和磷酸盐等。

实际案例—哌啶检测


2,4-二硝基氟苯(2,4-EXJFB)作为衍生化试剂,对衍生化产物2,4-二硝基苯基哌啶进行定量测定[3],反应方程式如下:


衍生条件:取限度浓度哌啶,加入催化剂NaHCO3约0.2g,涡旋1min,摇匀,室温静置反应1h后,15000r/min高速离心10min,取上清液即得。

溶剂

保留时间/min

DMSO稀释剂

/

哌啶空白

/

氟苯测试液

/

样品测试液

/

样品测试液+限度浓度哌啶

9.358

阳性对照

9.358

 



该方法的灵敏度(检测限,S/N,5-6)相当于供试品浓度0.0003%。


参考文献

[1] 液相色谱检测方法(第2版)—云自厚等编著

[2] 一种测定原料药中哌啶残留量的高灵敏度的方法。

[3] 黄柏林,头孢噻肟钠中残留乙酸的测定方法研究[J].华章2010,(35).

来源: 药事纵横



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