分享一篇发表在Angew上的文章。文章的题目是“Quantitative Reactivity Profiling of Functional Arginine Residues in Human Cancer Cell Line Proteomes”。文章的通讯作者是来北京大学化学与分子工程学院的雷晓光教授。该团队主要研究领域包括化学生物学，天然产物合成，药物化学等。

精氨酸是蛋白质中关键的功能性氨基酸。其带正电的胍基侧链在酶催化、维持蛋白质结构、介导蛋白质-蛋白质/蛋白质-核酸相互作用等关键生物学过程中扮演着核心角色。与半胱氨酸、赖氨酸等其他亲核氨基酸相比，精氨酸的胍基在生理条件下质子化程度高，反应活性较低。此外，传统的靶向精氨酸的试剂（如二羰基化合物）存在选择性差、产物不稳定等问题，难以应用于复杂的全蛋白质组研究。化学蛋白质组学技术（如活性基团蛋白质谱分析，ABPP）已在系统性发现半胱氨酸、赖氨酸等高活性氨基酸方面取得巨大成功。然而，缺乏能够在全蛋白质组范围内选择性、定量地描绘精氨酸反应性的化学工具和方法。这导致大量功能重要的精氨酸位点被忽视，成为蛋白质功能和药物开发的一个“盲区”。

作者基于前期经验，开发了基于苯乙二醛的探针AP-1，该探针带有炔基标签，可用于后续的“点击化学”连接与富集。首先，作者成功搭建了定量分析平台。他们将AP-1探针与同位素串联正交蛋白水解-活性蛋白质谱分析（isoTOP-ABPP）技术相结合。具体流程是，将四种不同的人类癌细胞系（MDA-MB-231、HepG2、Caco-2和HeLa）的裂解液，分别用低浓度和高浓度的AP-1进行标记，然后通过点击化学连接上轻重同位素标签的生物素分子。经过链霉亲和素珠富集、胰蛋白酶和TEV蛋白酶两步酶解，最终通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行定性和定量分析。通过计算轻重同位素标记肽段的强度比值（R值），他们能够定量评估每个被捕获的精氨酸位点的内在化学反应性，其中R值接近1的位点被定义为“超高反应性”精氨酸。

在平台搭建完成后，研究进行了大规模蛋白质组学分析。通过对质谱数据的解析，作者在约17,000个定量位点中，鉴定出分布在390个蛋白质上的超高反应性精氨酸位点。生物信息学分析表明，这些蛋白显著富集于碳代谢、糖酵解等代谢通路，以及基因表达调控和核酸结合相关蛋白中，提示这些精氨酸在关键生物学过程中扮演着重要角色。

为了验证这些发现的功能性意义，研究展开了多层次的功能验证。针对代谢酶，作者选取了糖酵解通路中的关键酶——丙酮酸激酶M（PKM）、乳酸脱氢酶A（LDHA）、乳酸脱氢酶B（LDHB）以及能量代谢相关的脑型肌酸激酶（CKB），对其鉴定出的高反应性精氨酸（如PKM的R43、LDHA的R171、LDHB的R172、CKB的R236、R320和R341）进行了定点突变。体外酶活实验证实，这些位点的突变（尤其是R106/R169对于LDHA，R107/R170对于LDHB，以及R236/R320对于CKB）能显著降低酶的催化活性，证明这些此前未被重视的精氨酸对于维持酶功能至关重要。

除了酶活性中心，本研究还深入探究了位于蛋白质相互作用界面的高反应性精氨酸。对于RNA解旋酶EIF4A1，他们通过哺乳动物双杂交实验和等温滴定量热法（ITC）证明，其超高反应性位点R168和R283是与抑制蛋白PDCD4结合的关键残基，突变这些精氨酸会完全破坏两者的相互作用。同样，对于DNA结合蛋白FUBP1，计算模拟和ITC实验共同表明，其KH1结构域上的R118位点直接与单链DNA的FUSE元件接触，该位点的突变会大幅削弱结合亲和力，并在细胞模型中影响下游基因表达和细胞增殖。为了进一步揭示这些功能性位点的表型影响，研究聚焦于CKB的R341位点。作者在Caco-2细胞中敲低内源CKB后，回补野生型或R341A突变体，发现突变体显著抑制了细胞的增殖和迁移能力。机制上，通过LC-MS/MS代谢物检测，他们发现R341突变导致细胞内的磷酸肌酸/肌酸比率下降，这表明该位点通过破坏CKB介导的细胞能量缓冲系统，从而损害了肿瘤细胞的恶性表型。

最后，本研究将基础发现推向转化应用，进行了共价抑制剂的开发。基于LDHA活性口袋中存在关键高反应性精氨酸R106和R169的发现，作者以已知非共价抑制剂88N的结构为基础，引入了苯乙二醛基团，设计并合成了共价抑制剂ArGO-LDHA-1。研究表明该抑制剂具有时间依赖性和不可逆的抑制特性。竞争性ABPP实验和直接的质谱分析最终确证，ArGO-LDHA-1能够选择性地、共价地结合在LDHA的R106和R169位点上，实现了对靶蛋白的长效抑制，为开发靶向“不可成药”蛋白的精氨酸位点的共价药物提供了概念验证和全新路径。

本文作者：THT

责任编辑：LYC

DOI：10.1002/anie.202515603

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202515603