论文DOI：10.1021/acscatal.3c05489本研究基于酶催化单元模块按需组合的多酶合成路线构建思路，建立了甲醇生产D-、L-和外消旋乳酸的多酶催化合成途径；通过优化单元酶催化模块和多酶系统，将乳酸产物浓度提高到2.2–2.8 g/L，最大合成速率达到9.6–15.6 g/L/天，乳酸光学纯度达到99%。在自然演化的过程中，自养微生物逐步演变出固定CO2的途径，将其转化为有机生物质，例如卡尔文循环（占90%）、还原性TCA循环、WL途径等。然而，这些天然的固碳途径存在一些缺陷，如固碳途径长，效率低（受到高氧化态CO2的限制，需要克服较高的能垒，使得羧化酶成为限速步骤）。随着合成生物学的发展，研究者逐步聚焦于人工固碳途径，主要包括改良天然固碳途径以提高固碳效率，以及设计全新的固碳途径。2016年，Erb团队构建了第一条体外人工固碳途径（CETCH循环），共包含17个酶，实现了乙醛酸的从头合成，固碳效率达到5 nmol CO2/(min·mg)，为构建人工固碳途径开辟了新的道路（Science 2016, 354, 900–904）。2021年，马延和团队以CO2和H2为原料，设计了人工淀粉从头合成途径（ASAP），固碳效率达到22 nmol C/(min·mg)，比玉米中的淀粉合成速率高约8.5倍（Science 2021, 373, 1523–1527）。这些突破为后续的研究人员提供了宝贵的参考。除了CO2的直接固定外，对其还原衍生物（如甲酸和甲醇）的利用和转化以合成多碳化学品也至关重要。其中，甲醛酶（FLS）是一种苯甲醛裂解酶，首次通过蛋白质设计进行工程改造，用于直接连接C1单元酶催化剂（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, 3704–3709）。FLS能将三分子甲醛缩合成一分子DHA，成为唯一已知的能够催化C1到C3转化的酶。由于DHA可通过磷酸化进入糖酵解途径成为最终产物，因此甲醛酶可以轻松地整合到代谢中，实现一生二，二生三，三生万物的理念。尽管相对于CO2的固定，甲醛酶催化的缩合反应在热力学上更为有利，但其局限在于催化活性低，需要通过蛋白质工程大幅提高其活性。乳酸是我们最为熟悉的平台化合物之一。工业上约90%的乳酸是通过微生物发酵法生产的。然而，其原料主要依赖于糖类化合物和部分生物质。糖类物质（如葡萄糖）的持续供应存在不确定性，并且与我们竞争粮食的消费，可能引发潜在的粮食安全问题。生物质虽然可作为替代原料，但由于无法被微生物直接利用，其前处理也会带来一定成本负担。因此，迫切需要开发新的乳酸合成途径以解决这些问题。鉴于先前的研究人员在人工固碳领域的杰出工作，我们也希望在此基础上进一步设计更多的固碳途径。我们选择乳酸作为目标分子，因其具有两种构型（D-乳酸和L-乳酸）。迄今为止，从C1原料到光学纯的乳酸生物合成途径尚未有报道。我们基于途径短、能量供应较少、采用纯酶法的原则，设计了三条非天然的L-、D-和外消旋乳酸的合成途径。途径中所有酶的基因序列是可获得的，以便于后续的分子学操作。最后，我们对途径进行了不同方面的优化，以尽可能提高整体的乳酸合成水平。我们将整个合成路线划分为两个模块。模块一的底物是甲醇，可通过电化学催化从CO2制备而来，经过AOX和FLS双酶催化得到产物DHA。这个模块也是构建C1原料的生物利用途径常用的模块。模块二则是从DHA出发，经过3-4步反应合成D-、L-和外消旋乳酸。关于模块二，起初设计了多种合成路线，考虑到路线长度、辅因子需求、手性控制、热力学以及催化剂的效率，最终选择了图中的路线。整体合成路线在热力学上是有利的，有助于推动级联反应的正向进行。在设计好合成路线的基础上，接下来是筛选对应步骤的酶元件。尽管一些反应步骤已经被报道，但我们仍然尽可能筛选更多的基因，旨在找到催化效率更高的元件，并为后续研究提供更多功能酶信息。其中，我们首次挖掘到在大肠杆菌中可溶性表达，并且对甲醇具有氧化活性的醇氧化酶AOX。我们对其进行了三轮定向进化，使其催化效率提高了5倍，kcat达到了10 s–1。然而，总体而言，FLS和AOX仍然是限速性步骤。在后续工作中，我们将继续对它们进行分子改造，以进一步提高其催化效率。除了通过蛋白质工程提高限速酶的效率外，我们还尝试进行反应工程的优化，以提高整条合成路线的整体合成水平。在模块一中，由于中间体甲醛的毒性，我们重点对催化剂的载量进行了优化，使得DHA的合成速率接近最快，从而减少体系内甲醛的积累。在模块二中，我们重点优化了涉及磷酸基团转移的反应步骤。根据之前的热力学计算结果显示，磷酸化和ATP再生循环相对于其他反应而言热力学上不利，因此成为限速步骤。通过文献调研，我们发现多聚磷酸和Mg2+的浓度对热力学平衡有影响。因此，我们对这两者的组合进行了细致的探究，筛选出了合适的反应条件，进一步提高了合成速率。综合而言，模块二能够实现15 g/L的合成水平。
在最终设计级联合成模式时，我们对各元件对甲醛的耐受性进行了表征，发现DHAK和D-LDH对甲醛的毒性影响较大。为了缓解甲醛的抑制作用，我们设计了一种一锅两步法的合成方法。在起始反应中，我们首先投入模块一进行反应，经过3小时后甲醛的积累减少，然后我们继续将模块二投入反应中，持续进行3小时。总体而言，人工乳酸合成途径能够达到2.2–2.8 g/L的合成水平。从C1原料甲醇出发，我们设计了三条到D-、L-和外消旋乳酸的多酶催化合成途径。通过模块化的构建和过程强化，最终实现了2.2–2.8 g/L的乳酸合成水平，最大合成速率达到了9.6-15.6 g/L/天，并且乳酸的光学纯度达到了99%。总体而言，该路线仍然受到模块一的限制，因此，通过蛋白质工程大幅提高FLS和AOX的催化活性将会是后续的重要工作。虽然人工乳酸合成途径相比传统发酵法具有一些优势（如底物供应、途径简短、易于操控），但不可否认的是，以糖和生物质为原料的发酵法能够实现很高的滴度（百克每升）。因此，我们将在未来的工作中进一步优化合成路线，以降低成本、提高产率。因此，无论是人工乳酸的合成还是其他产品的从头（C1原料）合成，都处于一种“理念”状态，短期内难以实现。因此，需要更多的工程研究来实现从“0到1”到“1到100”的技术需求，我们需要投入更多的工作，以真正为碳中和做出贡献。
最后，总结一下，关于生物固碳的工作可以围绕以下几个方面展开：1. 探索新的天然固碳途径（难度大，可以考虑脱羧途径）；2. 研究羧化酶（发现新酶、研究机制、探索催化功能）；4. 从C1原料合成多碳化合物（探索丙氨酸、三羟基丙酸、丙烯酸、草酰乙酸甚至六碳化合物等）。
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