分享一篇发表在Chem上的文章，通讯作者是莱斯大学的Han Xiao助理教授，他们课题组的研究方向是开发新型化学工具用于生物大分子修饰、抗体-药物偶联物开发以及嵌合抗原受体疗法。
遗传密码子扩展技术的发展为得到具有全新结构、功能的蛋白提供了一种可行的途径，但在实验中非天然氨基酸绝大多数都通过化学合成后添加到培养体系中，这种外源加入方式的生物利用率较差，尤其是在真核动物中非天然氨基酸通常具有较差的药代动力学，限制了其在活体动物内的使用。因此本文作者希望通过改变内源的生物合成途径来在细胞内生成非天然氨基酸，并位点特异性地插入到蛋白上。他们把目光投向了5-羟色胺(5HTP)，这种物质在真核生物中由羟化酶T5H在辅因子BH4的存在下由色氨酸合成，此前曾有人尝试将原核生物中存在的苯丙氨酸-4-羟化酶(P4H)的底物改造为色氨酸，从而使原核生物合成5HTP。为确定最合适的羟化酶，他们在细菌中引入不同的P4H或T5H，并同时引入PCD，DHMR两种酶来实现P4H辅因子MH4的循环，通过一个在Tyr151处为amber codon的GFP序列来作为报告基因，在大肠杆菌BL21中检测GFP表达量后他们发现XcP4H酶带来了最高的蛋白表达量。在XcP4H酶的基础上对实验条件进行优化后，他们的内源生物合成5HTP最终纯化得到的GFP量(10.5mg/L)仅略低于外源加入1mM 5HTP得到的蛋白量(12.5mg/L)。
结合此前作者开发的5HTP与重氮苯的高效偶联反应，这些通过内源生物合成插入到蛋白上的5HTP可以后续连接上不同的功能性分子。为展示在抗体偶联物上的应用，作者在大肠杆菌中表达了第113位插入5HTP的anti-HER2，经纯化后与一个带有重氮基团的香豆素进行偶联，通过ESI-MS证实有超过90%的标记效率，并随后成功对SK-BR-3细胞进行了荧光标记。
由于5HTP内源生物合成途径中的还原性辅因子MH4对氧化压力较为敏感，而MH4含量的下降会影响5HTP的生物合成，因此作者猜想这种体系很适合用于监控细胞内的氧化压力。通过生化实验他们发现，随着加入过氧化氢浓度的提高，经改造后的细菌内的5HTP含量逐渐下降，而5HTP的前体色氨酸的含量则基本稳定。通过检测GFP的荧光信号他们发现，在0.2-0.5mM的过氧化氢浓度范围内，细菌表现出了高灵敏度的荧光信号响应。
总之，这篇文章通过人为引入5HTP生物合成途径，利用细菌内源产生的5HTP作为非天然氨基酸来对蛋白进行插入，结合与重氮苯的偶联反应可对蛋白进行功能化的改造，并可对细菌内氧化压力进行响应。
本文作者：LDY
责任编辑：LYP
原文链接：https://www.cell.com/chem/fulltext/S2451-9294(20)30363-6
原文引用：DOI: 10.1016/j.chempr.2020.07.013
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