聚氨基环糊精对pUC19和生物学测定的结合能力

AmCDs对pUC19和生物学测定的结合能力

我们还测试了我们的AmCD结合质粒DNA的能力。为此，将每种AmCD与各种N / P比率（环糊精核心上的平均氮原子数/ pDNA的磷酸基团数）混合，并通过电泳迁移率变动分析（EMSA）评估络合效率。当对pDNA进行电泳时，可以检测不同的形式，即环状，线性和超螺旋的拓扑异构体（图8 ;在一些pDNA制剂中，甚至在RNA酶处理后，可以存在RNA）。进行两组实验：第一组（图8a），每种AmCD具有相同的N / P比，第二组具有更合适的N / P比（图8b）。

获得的结果表明CD1对于CD2和CD3具有最佳的针对pDNA的结合能力（由于AmCD结合，pDNA缺乏凝胶中的迁移）。实际上，CD1几乎完全以N / P 16.5结合pDNA的超螺旋构象，而线性结构在38.5。CD2和CD3均在N / P 49.5几乎完全结合pDNA的超螺旋构象，线性分别在38.5和27.5。对于CD1，CD2和CD3，缺乏RNA迁移分别发生在N / P 16.5,27.5和16.5 。表2总结了完全结合的最小N / P比

AmCD对pDNA的表观结合能力的差异可能取决于影响它们相互作用的几个因素，即AmCD的多胺臂的平均数和长度，以及多核苷酸聚阴离子的固有柔性。实际上，具有超螺旋pDNA 的CD1的最佳性能与使用Alg获得的结果不一致。值得注意的是，在使用的pH条件下（即pH 7.5），CD1与CD2和CD3相比具有较低的平均电荷（约6.2）。（大约10.4）。考虑到由于其独特的构象，带负电的磷酸基团的更接近的配置使得能够优化与阳离子AmCD的静电相互作用，可以容易地解释对pDNA的不同结合效率。还可以合理地假设聚阳离子的存在可以诱导相当柔韧的pDNA聚阴离子中的显着构象变化，代价是诱导一定量的应变。当然，对于更硬的Alg结构，这些变化几乎不会发生[55]。因此，CD1因此，由于其较小的电荷，结合涉及较大量的聚阳离子单元，每个聚阳离子单元沿着聚阴离子链诱导相对小的应变。相比之下，带电最多的CD2或CD3单元会导致更大的应变，从而使相互作用不稳定。为了完整起见，对AmCD-核酸复合物进行肝素激发试验以评估它们的稳定性。肝素是一种高度带负电荷的硫酸化多糖，可用作竞争聚阴离子。获得的结果（参见支持信息文件1，图S2）显示，CD1的肝素浓度为400μg/ mL，CD2的浓度为500μg/ mL时发生解离。和CD3。这表明与类似系统相比，DNA和AmCD之间的结合非常强[28,56,57]。

最后，研究了三种AmCD对大肠杆菌感受态细胞转化的影响。已经报道了环糊精改变了不同大肠杆菌菌株的转化效率，尽管不是以标准化方式。与对照实验相比，不同的环糊精衍生物可导致转化体数量减少10倍至增加4倍[58]。值得一提的是，细菌具有与细胞外DNA相互作用的不同方式。在某些情况下，它们可以自然地内化和整合外源DNA（天然能力），这可以导致获得新的遗传特性（例如，抗生素抗性基因）和多药耐药菌株的出现[59]。此外，细胞外DNA已被证明对病原菌如铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌 [60-62]的生物膜建立和维持很重要。一些其他细菌，例如大肠杆菌，在用氯化钙预处理后接着短时间的热或电击后可以经历短暂的能力。CaCl 2的加入促进了pDNA与革兰氏阴性细菌外膜的结合。Ca 2+离子既吸引带负电荷的DNA骨架又中和细胞表面的负电荷，从而避免细胞与磷酸DNA基团之间的静电排斥。对于其他细菌，这些方法效果不佳，因此难以接受外源DNA，基因操作受到阻碍[63-65]。后一种情况代表了细菌遗传操作和微生物生物技术的瓶颈，因为获得重组细菌菌株的程序是成本和耗时的。因此，难以操作的菌株的转化效率提高可能非常有用。

考虑到EMSA获得的结果，使用以下N / P比率进行转化测定：CD1为38.5 ，CD2和CD3为49.5 。作为参考，使用相同量的游离pDNA。令人惊讶的是，我们的实验表明，所有AmCDs都显示出对转化效率的不利影响，显着降低了细菌菌落的数量。事实上，转化效率，被认为是大肠杆菌细胞转化后获得的菌落形成单位数/μgpDNA（CFU），仅使用pDNA 就可以达到1.3·10 5。相比之下，CFU值急剧下降至约5·10 2当使用pDNA与CD1，CD2和CD3的复合物时，分别为2·10 2和1.4·10 4。该结果表明AmCD可以与细胞膜相互作用，例如通过静电相互作用，或中和pDNA的阴离子性质，使得在感受态细胞的制备中添加氯化钙毫无意义。