通过化学控制蛋白降解来调控蛋白表达水平，是研究蛋白质功能的新兴技术。它们依赖于小分子与特定设计的蛋白质结构域的选择性结合，来稳定或者降解靶蛋白，从而实现对蛋白质浓度的控制。美国加州大学尔湾分校的Robert C. Spitale教授课题组探究了DNA去甲基酶在靶向蛋白质降解中的应用。新型苄基鸟嘌呤底物具有控制细胞中蛋白质降解的能力，该研究证明了这种方法在活细胞内降解不同位置融合蛋白方面的效用。

首先，作者从O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶（hAGT）出发，对配体-蛋白复合物进行设计。hAGT是一种DNA修复蛋白，通过将烷基化DNA链上鸟嘌呤O6-位的烷基转移至自身活性中心的半胱氨酸上，来行使DNA修复功能。hAGT一旦烷基化，就会发生构象变化，失活后的hAGT蛋白会被泛素化并随后被蛋白酶体降解。先前，研究人员通过对hAGT进行突变改造，获得了SNAP-tag蛋白，它不与DNA链上的鸟嘌呤进行反应，但与小分子O6-苄基鸟嘌呤（BG）衍生物的亲和力极大地提高。SNAP-tag通常与靶蛋白（POI）融合，以使用基于BG的配体进行标记和纯化。SNAP-tag技术致力于创造稳定的蛋白质复合物，识别用于蛋白质烷基化的BG衍生物，而不会伴随降解。

为了同时实现选择性、有效的烷基化和诱导降解，作者推断hAGT的另一种变体^GEAGT将是测试融合蛋白降解的最佳起点。^GEAGT蛋白保留了SNAP-tag选择性结合BG的能力，同时在与BG结合后不稳定。因此，在设计嵌合分子时，需要一个O6-苄基鸟嘌呤（BG）在一端用于^GEAGT结合，另一端需要一个疏水部分（如金刚烷基），或特定的E3连接酶招募配体（如沙利度胺）（图1a）。用于连接两者之间的接头部分及招募配体的类型需要进一步确定。为此，作者合成了4种配体，包含BG（^GEAGT-recruiting）、金刚烷基或沙利度胺单元（图1b）。

在确定了4种配体都能够与^GEAGT中的活性位点结合之后，作者探究了配体结合后是否能够增加蛋白质降解。为此，作者构建了稳定表达核定位^GEAGT-mNeonGreen融合蛋白的细胞系，并在一定浓度范围内培养该细胞24 h后，通过流式细胞仪对mNeonGreen荧光进行量化（图2a）。如图2b所示，具有较短PEG接头的金刚烷基化合物（BG-PEG1-Ad）使mNeonGreen荧光降低得最显著。即使在最低测试浓度（1 μM）下，荧光强度也约为BG对照组的20 %。而含沙利度胺的化合物对^GEAGT-mNeonGreen融合构建体的降解有限。与流式结果一致，mNeonGreen蛋白质印迹的结果也显示，与BG-PEG1-Ad的孵育导致蛋白质降解最多（图2c）。

接下来，作者探究了BG-PEG1-Ad配体对一系列细胞定位融合蛋白的降解效果。为此，作者分别克隆了细胞核定位序列（NLS）、细胞质定位序列（NES）、膜结合（N-末端肉豆蔻酰化（Myr）、C-末端法尼基化（CAAX））和跨膜（CD8）的融合蛋白。在每个构建体稳定转染后，将细胞与BG-PEG1-Ad一起培养24 h。蛋白质印迹的结果显示，每种构建体的蛋白量都显著降低，这与显微镜观察到的荧光减少一致（图3a）。随后，作者通过细胞成像观察到，目标蛋白既符合预期定位，又降低了相应的表达水平（图3b）。总体而言，这些数据证明了配体-蛋白复合物BG-PEG1-Ad-^GEAGT在靶向蛋白质降解方面的灵活性，以及将^GEAGT蛋白与细胞不同部位的POI融合以有效降低蛋白质丰度的灵活性。

总的来说，该研究介绍了一种新型配体-蛋白复合物，与PROTAC/Halo-PROTAC系统一致，可用于靶向蛋白质降解。此外，^GEAGT与具有亚细胞定位的蛋白质的融合，导致了预期位置蛋白质表达水平明显降低，因此，预计该方法可应用于多种蛋白质的降解。