通讯作者：Karsten Haupt, Guoqing Pan 通讯单位：Université de Technologie de Compiègne, Jiangsu University 论文DOI：10.1002/anie.202106657 本文使用固相印迹策略合成了两种分子印迹人工酶抑制剂，它们对胰蛋白酶和血管生成素表现出出色的特异性和有效的活性抑制作用。其中，胰蛋白酶抑制剂有效平定胰蛋白酶消化诱导的细胞外基质裂解和细胞膜破坏，血管生成素抑制剂通过抑制血管生成素的核糖核酸酶活性和降低肿瘤细胞内外的血管生成素水平阻断肿瘤细胞增殖。该工作展示了分子印迹人工酶抑制剂在调控细胞进程方面的可行性，显示其作为生物医学治疗药物的巨大潜力A. 研究的核心问题：量身定制的大分子人工酶抑制剂酶抑制在代谢控制中起着重要的作用。通过特异性结合和阻断酶的活性位点，天然酶抑制剂能够纠正代谢失衡，或被用来防御病原体和其他有害生物。然而，天然酶抑制剂容易被体内的水解酶降解，不宜作为药物使用。同时，可大规模生产的有机小分子抑制剂对目标酶的特异性很差、负作用强。因此，研制高特异性的人工酶抑制剂得到了越来越多关注。为了量身定制对目标酶有特异性识别作用的大分子类抑制剂，分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer, MIP）具有独特优势。与一般的高分子材料相比，MIP中的官能团呈现出空间结构上更加合理的分布，进而组成与模板分子的尺寸和形状互补的结合位点。所以，MIP是作者首选的大分子类型的人工酶抑制剂。近20年来，同行专家们孜孜不倦地探索分子印迹人工酶抑制剂的合成方法，已经取得了不错的成绩（Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41: 4459-4463；J. Am. Chem. Soc. 2021, 143: 639-643）。为了克服印迹蛋白的困难，许婧靓博士期间优化了一种固相印迹策略，即先把目标蛋白固定于功能化的载体，再通过自由基聚合反应合成水溶性MIP纳米颗粒。固相印迹策略可以方便、快捷 、低成本地合成MIP，所合成的MIP对蛋白质的亲和力和选择性可以与天然抗体相媲美。研究过程中，作者一直都存在两个疑问：（2）如果可以针对酶的活性位点设计合成MIP，是否可以将该纳米材料用作纳米药来治疗疾病。B. 有待填补的领域研究空白：基于酶活性抑制的细胞进程调控研究针对上述两个问题，作者针对胰蛋白酶（一种胞外丝氨酸酶）和血管生成素（一种与肿瘤细胞增殖相关的胞内活性酶）开展相关研究。首先，作者建立了酶的3D模型并找出其活性位点，再测试固定后酶的活性以确定活性位点是否暴露在外。然后，作者通过固相印迹策略制备了两种分子印迹人工酶抑制剂，即分子印迹胰蛋白酶抑制剂和分子印迹血管生成素抑制剂。目前，分子印迹人工酶抑制剂的研究主要集中在酶的活性抑制领域，面向更高级的应用如病理细胞调控一直是领域研究空白。因此，在酶活性抑制的基础上，作者进一步探索了分子印迹人工酶抑制剂调控细胞进程的表现，为未来该材料用作纳米药物进行疾病治疗夯实基础。秉承着好奇心驱动的创新精神，围绕着筑牢基础的共识，精进于反思、成长于实践，许博士在法国博导karsten Haupt教授课题组主要开展蛋白3D模型以及分子印迹人工酶抑制剂的制备。回国后，在与潘国庆教授紧密合作与启发下，探索了分子印迹人工酶抑制剂用于动态活细胞生命进程调控的表现。本文历时三年，精益求精，最终实现了基于酶活性抑制的细胞进程调控，并详细阐明了酶活性抑制与细胞外基质、细胞膜蛋白、细胞增殖的内在关系。研究表明，α1-抗胰蛋白酶是一种主要由肝细胞产生的糖蛋白，其主要功能是保护组织免受蛋白酶的损伤。α1-抗胰蛋白酶缺乏会导致细胞外基质中蛋白质的胰蛋白酶降解，从而导致炎症和组织损伤。然而到目前为止，还没有开发出治疗α1-抗胰蛋白酶缺乏症的药物。因此，作者制备了分子印迹胰蛋白酶抑制剂，用于抑制过量活性胰蛋白酶引起的肝损伤。结果表明，分子印迹胰蛋白酶抑制剂属于竞争性抑制剂，抑制常数Ki = 3.4 nM, 可以与天然的胰蛋白酶抑制剂相媲美。此外，作者还探索了分子印迹胰蛋白酶抑制剂在抑制胰蛋白酶消化诱导的细胞外基质和细胞膜蛋白破坏中的应用。实验表明，合成的分子印迹胰蛋白酶抑制剂不仅对活性胰蛋白酶拥有优异抑制作用，而且可以防止胰蛋白酶消化细胞外基质和膜蛋白，表明其在治疗由活性胰蛋白酶而引起的正常细胞损伤方面具有巨大潜力。▲Figure 1. (A) 3D trypsin model showing active site composed of His55, Asp99 and Ser192 highlighted (PyMOL using PDB entry 2PTN), as well as the proposed coordination position between IDA-Cu2+ and trypsin. (B) Lineweaver-Burk plot of trypsin activity in the presence of 50 mM N-(4-vinyl)benzyliminodiacetate-Cu2+ (l); 50 mM PAB (¿); as well as trypsin activity in blank solution (D). Insert table: KM and Vmax values obtained by analysis of Lineweaver-Burk plots (C) Binding isotherms of MIP_trypsin (l) and NIP_trypsin (Control_trypsin ▲) towards trypsin. (D) Binding selectivity of MIP_trypsin. (E) Lineweaver-Burk plot for trypsin inhibition by MIP_trypsin.
▲Figure 2. L-02 liver cells adhesive behavior and injury study. (A-C) Lens fixed for cell imaging in RPMI 1640 medium at 37 °C taken at indicated time intervals within 120 min. Scale bar is 100 μm. (D) Schematic illustration of tryptic digestion-induced ECM lysis and cell membrane protein destruction. (E) Cell viability after different treatment at time 2 h and 12 h, control is non-treated L-02 cells. Asterisks indicates **p < 0.001 or *p < 0.01.
血管生成素在多种组织微环境中存在，对多种靶细胞的生长、增殖、迁移和存活等细胞行为都可进行调控，进而参与肿瘤生长、血管新生、神经退行性疾病等生理病理过程。迄今为止，在20多项临床研究中观察到血管生成素的含量在多种癌症病变组织中升高，亦与肿瘤预后呈现负相关。因此，血清血管生成素水平已被认为是肿瘤诊断的潜在指标，有着非常高的临床应用价值。因此，作者研制了分子印迹血管生成素抑制剂，用于血管生成素的核糖核酸酶活性的抑制，从而阻断由血管生成素引发的肿瘤细胞增殖，经计算得其最大半数抑制浓度（IC50）为6 nM，表明其对血管生成素的有效抑制作用。在此基础上，将分子印迹血管生成素抑制剂用于抑制血管生成素诱导的肿瘤细胞增殖，实验结果显示分子印迹血管生成素抑制剂能够有效捕获血管生成素进出癌细胞，随后引起血管生成素的活性下调从而起到对癌细胞增殖有效抑制的作用。进一步研究表明，分子印迹血管生成素抑制剂对血管生成素水平的抑制作用甚至比天然酶抑制剂更好，其强抑制特性可以持续5天，这表明化学合成的大分子酶抑制剂作为长效癌症治疗药物具有稳定的性能，在临床实践中具有良好的应用潜力。▲Figure 3. (A) 3D structure of angiogenin (model established on Cn3D 4.3.1 3-D structure viewer using PDB entry 1ANG, active site: His 13, Lys 40 and His 114) with similar active site as RNase A (model established on Cn3D 4.3.1 3-D structure viewer using PDB entry 1BEL, His 12, Lys 41 and His 119). (B) Proposed coordination between IDA-Cu2+ and RNase A (established on PyMOL using PDB entry 1BEL). (C) Binding isotherms of MIP_RNase (l) and NIP_RNase (▲) for angiogenin, as well as MIP_RNase for RNase A (■)sodium phosphate buffer, pH 7. (D) Binding selectivity of MIP_RNase for angiogenin and other proteins. (E) Inhibitory effect of MIP_RNase on angiogenin.
▲Figure 4. (A-C) CLSM images of (A) L-02, (B) 231 and (C) HeLa cells, after incubation with 5 nM MIP_RNase for 80 min. Nucleus was stained with DAPI (blue). The green staining indicates the presence of MIP_RNase. Scale bar is 50 μm. (D) Flow cytometry analysis of HeLa cells with no treatment, after incubation with Alexa Fluor 488 antibody, inhibited by MIP_RNase then marked by Alexa Fluor 488 antibody. (E) Viability of HeLa cells after 48 h incubation with MIP_RNase, NIP_RNase and RI. (F) Cell viability after incubation with 5 nM of MIP_RNase or NIP_RNase or RI for 0, 12, 24, 48, 120 h, control is the record of non-treated HeLa cells. (G) Extracellular and intracellular levels of angiogenin after cell incubation with 5 nM MIP_RNase or RI for 48 h. Asterisks indicates **p < 0.001 or *p < 0.01.
本文通过固相印迹策略成功地合成了两种分子印迹人工酶抑制剂，这些酶抑制剂具有高特异性并且对胰蛋白酶和血管生成素具有有效的抑制作用。首次证明了分子印迹人工酶抑制剂从简单的活性抑制到病理性细胞调节的提升。例如，对活性胰蛋白酶具有优异抑制作用的胰蛋白酶抑制剂可以防止胰蛋白酶消化诱导的细胞外基质水解，表明其在治疗活性胰蛋白酶引起的正常细胞损伤方面具有巨大潜力。 此外，血管生成素抑制剂也可用于抑制由于血管生成素而引起的肿瘤细胞的快速增殖。因此，该工作为分子印迹人工酶抑制剂应用于治疗细胞水平的疾病开辟了新的视角。近五年来，由于基因工程、细胞工程、蛋白质工程以及仿生技术的进步，大分子药物的研制已获得关键技术突破。由于大分子药物本身具有生物活性，其毒性作用往往与药效相关，与小分子药物相比，脱靶效应较为少见，在人类疾病预防、治疗和诊断领域具有广泛的应用前景。随着越来越快的发展速度，大分子药物的市场占有率也会越来越高。作者对前人的研究进行了实质性推进，采用固相印迹法研制新型酶抑制剂用于病理性细胞行为的调控，其出色的抑制功能有望为肝细胞损伤、肿瘤治疗等相关领域提供新的解决方案，可为靶向性大分子药物研发提供方案。这个课题从开始初探到最终发表，历时近三年，得益于潘国庆教授的辛勤指导和大力支持，也得到了来自海外博导Karsten Haupt的鼎力相助。特别需要感谢的是疫情期间，为了补充论文发表所需的实验，在实验室与许博士一起日夜奋斗的研究生们、以及课题组同事的支持。
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202106657
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