利用微流控系统对单细胞生物钟相互耦合的研究

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生物节律是地球生命体最普适的特性之一。为维持身体机能的周期性高活性-低活性循环,生命体演化出一套生物节律调节系统,也称之为生物钟。生物节律对于动植物和人类的生活有着重要意义。经过研究发现,人体一天之内的体温、血压变化,及全身各处的器官组织活性的变化等生物生理状态均受到生物节律的调节。生物节律的失调将导致睡眠紊乱,内分泌系统失调等一系列症状。因此,对生物节律的调控机制的研究变得尤为重要。

图 1. 细胞生物钟的基因调控作用通路

从基因层面展开,细胞内生物节律的调节机制已经得到了广泛的研究。细胞内存在四种生物节律调控的决定性基因:Per 基因,Cry 基因, Clock 基因和 Bmal1 基因。其中 Clock 基因的表达物 CLK 蛋白和 Bmal1 基因的表达物 BML1 蛋白形成的复合体 CKL/BML1 能够提高 PER 蛋白和 CRY 蛋白在细胞内的产量,而 Per 基因的表达物 PER 蛋白和 Cry 基因的表达物 CRY 蛋白形成的复合体 PER/CRY 又反过来限制其蛋白(PER 蛋白和 CRY 蛋白)在细胞内的积累。图 1 展示了参与节律调控的四种关键基因的作用通路。这四种基因表达的负反馈回路形成一个以 24 小时为周期的 PER 蛋白和 CRY 蛋白的浓度震荡,即细胞的生物节律。

单细胞生物节律的基因调控机制已经得到了充分的研究。但多细胞生物的节律调节需要细胞间的相互协作。多细胞生物的细胞各自拥有内源的 24 小时节律调节通路,但如果细胞之间的节律不能同步化,将造成整体节律的失衡。在哺乳动物的大脑内,各生物节律相关的神经元表面存在有多种神经递质受体,并且通过对应神经递质相互关联,从而形成稳定的生物节律。经过研究发现,VIP 是生物节律调节系统中重要的神经递质之一,通过使用外源VIP刺激大脑生物钟控制区域能对生物节律产生显著影响。目前认为 VIP 可以结合其细胞表面受体VPAC2,触发下游信号通路,促进生物节律基因(Per,Cry 基因)的表达,使细胞间的生物节律产生同步化。但 VIP 本身是否足够可以使神经元和单细胞之间的生物钟产生稳定的耦合还没有定论。

目前对哺乳动物单细胞生物钟的研究还是采用比较传统的培养皿培养细胞的方法。单细胞通过分子生物学的技术,将一段荧光素酶的基因融合到生物钟基因 Per 或者 Cry 基因中去,利用其产物荧光素酶与培养基中的荧光素结合产生的自发光作为探测信号,反映 PER 蛋白或者 CRY 蛋白在细胞内的表达量,以此来观测单细胞的生物节律。培养皿培养细胞的方法,只需要将细胞封闭在装有适量培养液的培养皿中,就可以进行观测实验。问题是此方法不能进行周期性的外界药物刺激,因为频繁的换药加药会给细胞的培养环境带来大的变化,从而影响细胞的生长状态和观测结果。如果操作不够小心,还会带入生物污染。因此,为了更好的进行单细胞的生物钟研究,必须采用新的方法。

微流控技术是最近兴起的新技术,其利用光刻技术的优势,可以在一个硬币大小的面积里,制作出具有复杂功能的微流控芯片,可以在微小的体积内进行微量基因样品的准备,少量细胞的培养,蛋白晶体的生成等等。微流控技术另一个优势是可以进行自控化的流体控制,例如微流控芯片中液体流量的控制,液体流动开关的控制等等。这样就可以避免人工的介入,保证芯片内环境在整个实验过程中的一致性。因此微流控技术可以为单细胞生物钟的研究带来技术革新,也是我们将微流控技术应用于细胞生物钟研究的出发点。

图 2. 实验平台示意图

图 2 是我们的实验平台示意图。左图为实际实验平台,因为单细胞的生物节律通过其化学发光强度的周期性变化来体现,所以整个平台在一个封闭的暗室中。显微镜是主要的自发光探测工具,通过连接在显微镜上的 CCD,可以实现单细胞水平上的光学成像。右图是实验原理的示意图。微流控芯片放置在一个恒温恒湿的细胞培养小室中,通过显微镜物镜,将芯片中细胞的光信号传递到 CCD 中成像。

图 3. 芯片以及细胞培养小室

图 3 左图是实验所用的微流控芯片。我们所用的微流控芯片采用了双层的结构,上层为流体层(红色),主要用来培养细胞,给药,以及供给培养液。下层为控制层(绿色),通过气压注入控制层,来控制流体层中液体流动的通断,从而达到精准给药的目的。流体层的中间为四个独立的细胞培养小室,可以进行不同种类细胞的并行实验,从而提高实验的效率。图 3 右图为注入细胞后的四个小室。因为神经细胞的培养有很多技术上了难点,并且相对复杂,在我们的实验中,利用小鼠的成纤维细胞,通过合成生物学的技术,将 VIP 的细胞表面受体(VPAC2)表达在小鼠成纤维细胞中,这样,成纤维细胞就可以感知 VIP 分子,为研究 VIP 对单细胞生物钟的影响以及细胞间的生物钟耦合提供了一个简单的细胞体系。每个细胞中都表达了荧光素酶(PER2-LUC),利用其与培养液中的荧光素结合产生的化学发光反映 PER2 蛋白在细胞内的表达量,从而研究其生物钟在外界刺激下的变化相应。

图 4. VIP 对细胞生物节律的调制

实验中,我们先将小鼠成纤维细胞注入微流控芯片,如图 3 右图所示,等待两个小时的时间让细胞贴壁。通过控制芯片的控制层,让培养液以非常低的速度流动,从而减少培养液流动对细胞的冲击。每隔 24 小时,通过芯片上的给药入口,对小室中的细胞进行外源 VIP 的刺激,观测细胞对 VIP 的响应情况。图 4 为实验结果。A 是没有 VIP 刺激只有培养液的情况下的细胞的平均节律,可以看到整个小室中细胞的自发光的节律震荡是越来越弱的,说明单细胞的生物钟之间没有产生耦合,导致每个细胞都按照自己的生物节律进行 PER2 蛋白的表达。而 B 中,则是加入了以 24 小时为周期的外源 VIP 药物刺激的细胞平均节律,可以看出,经过三个周期的刺激后,VIP 刺激的效果越来越显著,细胞形成同步的节律震荡。

图 5. 芯片中细胞的实时发光图

为了形象的表示出 VIP 对细胞生物节律的调制作用,我们分别选取了第 115 小时,127 小时,139 小时和 151 小时时细胞的实时发光图,见图 5 中。上面一行对应没有药物刺激时的发光图,下面一行是加入 VIP 刺激的发光图。可以明显的看到加入 VIP 后,细胞的发光出现了同步亮暗的变化趋势。而没有 VIP 刺激的细胞,还是以各自的生物节律随机变化,并没有产生同步化的行为。


图 6. 单细胞生物节律在VIP刺激下的同步化

我们统计了对应图 4 中的两个小室的单细胞的自发光情况,得到图 6 中的热图。横坐标是时间,纵坐标是细胞个数,红色代表细胞生物节律的震荡峰值,蓝色代表细胞生物节律的震荡谷值。B 图为加入外源 VIP 的结果,对比 A 图,可以看到单个细胞的生物节律震荡几乎达到了相同的频率,具有了相对统一的峰值出现时间(红色)和谷值出现时间(蓝色),即单细胞生物钟的同步化。说明 VIP 通过与 VPAC2 结合,激发了 PER2蛋白的表达,能够让单细胞的生物钟之间产生耦合,从而达到同步的生物节律震荡。

综上,通过微流控技术与单细胞生物钟研究相结合,利用微流控芯片实现了长时间细胞培养,并研究了单细胞生物钟以及其相互间的耦合,证明了 VIP 能够产生单细胞生物钟的稳定耦合。该方法为单细胞生物钟的研究提供了新的平台和思路,为未来的生物钟研究提供了多种的可能性。


论文信息

  • A microfluidic approach for experimentally modelling the intercellular coupling system of a mammalian circadian clock at single-cell level
    Kui Han, Long Mei, Ruoyu Zhong, Yuhong Pang, Eric Erquan Zhang*(北京生命科学研究所) and Yanyi Huang*(黄岩谊,北京大学)
    Lab Chip.2020
    http://dx.doi.org/10.1039/D0LC00140F



    论文作者

    韩奎 博士

    博士毕业于北京大学物理学院,先后在美国加州大学圣地亚哥分校生物工程系和北京大学生命科学学院生物动态光学成像中心从事博士后研究工作。现为北京大学生物医学前沿创新中心研究助理。

    梅龙 博士

    博士毕业于北京大学生命科学学院。现在纽约大学医学院神经所从事博士后研究工作。

    张二荃 博士

    博士毕业于美国加州大学圣地亚哥分校分子病理专业。曾在美国加州斯科瑞普斯研究所从事博士后研究工作,先后担任美国诺华制药加州圣地亚哥研究院高级博士后研究员和美国加州大学圣地亚哥分校生物科学学院访问学者。现为北京生命科学研究所研究员。

    黄岩谊 博士

    本科和博士均毕业于北京大学化学学院,先后在美国加州理工学院应用物理系、斯坦福大学生物工程系从事博士后研究工作,2006 年回到北京大学工作。目前任北京大学化学学院教授,北京大学生物医学前沿创新中心研究员,北京未来基因诊断高精尖创新中心研究员,北大-清华生命科学联合中心研究员,工学院兼职教授。


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