摘  要：目的 采用人肝癌SMMC-7721细胞移植裸鼠，研究包载人参3种成分（齐墩果酸、熊果酸、人参皂苷Rg₃，OUR）的透明质酸（hyaluronic acid，HA）修饰的纳米脂质载体（HA-OUR-NLC）在荷瘤小鼠体内的分布情况。方法 以FITC和DiR为荧光探针，采用荧光内窥式共聚焦成像和小动物活体成像技术动态监测HA-OUR-NLC靶向到各组织器官的行为过程。结果  HA-OUR-NLC可明显提高齐墩果酸、熊果酸、人参皂苷Rg₃在肿瘤中的相对摄取率（RUE），分别达到2.51±1.23、2.27±1.43和2.77±0.25，表明经过HA修饰的纳米粒可增强药物在肿瘤中的摄取。DiR-HA-OUR-NLC组荷瘤裸鼠肿瘤区域可以明显观察到较强的荧光信号，显著高于DiR-OUR-NLC组。结论 HA-OUR-NLC能够在肝肿瘤部位富集，可明显提高给药系统的肿瘤靶向性。

中药某些抗癌成分具有明显的毒副反应，治疗窗窄，如莪术油具有溶血不良反应、斑蝥有效部位对泌尿系统有强烈的刺激性、乌头总生物碱对神经系统具有毒性等；另一方面许多有效成分溶解度低（如齐墩果酸、人参皂苷等）、半衰期短（如丁香苦苷、龙胆苦苷等）。生物利用度低和安全性方面的问题已成为制约中药多成分临床应用的关键问题^[1-2]。如何解决这一问题，也成为制约中药递药系统发展的难点，迫切需要设计出适合中药多成分特点的现代给药系统，更好地发挥其治疗作用。中药纳米递药系统的出现提供了新的给药途径，其具有增强药物的靶向性、提高生物利用度、降低毒副作用和增强缓释等优势，从而有效地控制和治疗疾病。

虽然纳米技术在中医药领域积累了不少成功经验，但将中药多成分形成纳米递药系统，无疑面临着平衡包封和均衡释放的问题^[3-4]。这是因为中药有效成分具有多样性的特点，其结构、理化性质和溶解度也存在差异^[5]。随着纳米递药系统在药物研发领域的渗透和影响，将中药多成分制成纳米粒，或将水溶性小及难溶性的药物加工成纳米颗粒，可提高药物的靶向性和生物利用度，增加药物的稳定性，增强疗效，减少毒性和不良反应，还可使药物进入到机体各级微细的组织管道和病变组织细胞中，大幅度提高药物的定位性、时效性和有效性，从而有效地控制和治疗疾病^[6]。

纳米脂质载体（nanostructured lipid carriers，NLC）是20世纪90年代发展起来的一种新型的固体骨架纳米递药系统，是将固体脂质和液体脂质高温熔融再低温固化而成。将难溶性药物包载到NLC中提高其生物利用度是一个值得关注的研究方向。NLC可以明显提高疏水性药物非口服给药的传递效率。它具有脂质药物载体的固有优势：难溶性药物在脂质成分中表现出良好的溶解度；所使用的脂质具有良好的生物相容性，可生物降解体，内毒性低；控制药物释放^[7]。

人参为五加科植物人参Panax ginseng C. A. Mey. 的干燥根，其中含有多种成分诸如人参皂苷、人参多糖、蛋白质等。其中具有确切抗肿瘤疗效的活性成分齐墩果酸（oleanolic acid，OA）、熊果酸（ursolicacid，UA）、人参皂苷Rg₃（ginsenosider Rg₃，Rg₃）水溶性差，生物利用度低，肿瘤靶向性差，限制了药效的发挥，使其临床应用受到限制^[8-10]。前期研究已采用NLC包载人参中3种难溶性有效成分OA、UA、Rg₃制备纳米脂质载体（OUR-NLC）^[11]。本研究采用透明质酸（hyaluronic acid，HA）作为靶向因子，经电荷吸附作用进行修饰得到HA-OUR-NLC，对其进行体内组织分布和小动物活体成像的研究，以期探索药物对各组织的靶向性；另外通过内窥式激光共聚焦成像系统（fluorescence in vivoendomicroscopy，FIVE）探讨HA-OUR-NLC能否靶向于肿瘤细胞，克服了普通共聚焦显微镜不能对体内组织细胞进行在体成像的缺点，实现动物活体内实时监测细胞尺寸水平，从宏观和微观2个水平探索HA-OUR-NLC的靶向行为。

1  材料与仪器

雌性BALB/C-nu纯系裸鼠，4～6周龄，体质量18～22 g，北京维通利华公司提供，合格证号1100111711015241。实验动物许可证号SCXK（京）2012-0001，实验和饲养均在SPF条件下的超净层流架中进行，动物自由摄取灭菌处理后的水和饲料。

人肝癌SMMC-7721细胞购自武汉博士德公司，用含有10%胎牛血清和1%双抗的RPMI 1640培养基，在37 ℃、5% CO₂及饱和湿度的条件下培养，取对数生长期的细胞进行实验。

对照品OA（质量分数≥98%，批号130826）、UA（质量分数≥98%，批号131107）、Rg₃（质量分数≥98%，批号131029），成都瑾哲生物有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱、BEH C₁₈ 色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、HLB型SPE柱，美国Waters公司；FA2004分析电子天平（上海良平仪器表有限公司）；小动物活体成像系统（英国Burker公司）；TGL-16C型离心机（上海安亭科学仪器厂）；Autotune高强度超声波细胞破碎仪（美国Sonics公司）。

2  方法

2.1  OUR、OUR-NLC和HA-OUR-NLC的制备

精密称取OA、UA、Rg₃各0.65 mg，DMSO溶解，用蒸馏水定容至5 mL，得总质量浓度为0.39 mg/mL的OUR溶液备用。

OUR-NLC和HA-OUR-NLC制备方法参照文献方法^[11]，其中OUR的质量分数分别为0.075%、 0.038%。

2.2  组织分布实验

2.2.1  色谱条件  血浆中OA、UA检测波长205 nm；流动相为甲醇-水（92∶8）；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量20 μL。血浆中Rg₃检测波长203 nm；流动相为乙腈-水（55∶45）；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量20 μL。

2.2.2  对照品溶液配制

（1）OA对照品溶液的制备：精密称取OA对照品5.04 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇定容，得到199.20 μg/mL的对照品储备液，分别精密量取对照品储备液适量于量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配成OA质量浓度分别为5.04、20.16、50.40、100.08、130.10 μg/mL的系列对照品溶液备用。

（2）UA对照品溶液的制备：精密称取UA对照品5.03 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，得到201.20 μg/mL的对照品储备液，分别精密量取对照品储备液适量于量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配成UA质量浓度分别为5.03、20.12、50.30、100.60、130.78 μg/mL的系列对照品溶液备用。

（3）Rg₃对照品溶液的制备：精密称取Rg₃对照品4.01 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，得到200.40 μg/mL的对照品储备液，分别精密量取对照品储备液适量于量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配成Rg₃质量浓度分别为4.01、16.04、40.10、80.20、150.30 μg/mL的系列对照品溶液备用。

2.2.3  模型制备与给药  取对数生长期SMMC-7721细胞，接种于BALB/C-nu纯系裸鼠右侧肩胛上方，每只小鼠接种1×10⁷个细胞，接种体积0.2 mL。接种肿瘤细胞后，待可观察到明显肿瘤结节时即建模成功（3～6周）。

取荷瘤小鼠30只，随机分为3组，OUR、OUR-NLC和HA-OUR-NLC组。给药前动物禁食不禁水12 h后，尾iv给药，给药剂量为10 mg/kg（以OUR计）。

2.2.4  样品处理  给药后，于10 min及0.5、1、2、3 h眼眶取血并脱臼处死小鼠，迅速摘取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肿瘤器官，用生理盐水洗净各组织表面的残血，并用滤纸将水分吸干，精密称定质量，加1 mL生理盐水，快速匀浆器制备成匀浆液。取组织匀浆200 μL，加乙腈溶液3mL，涡旋混合1 min，离心（10000 r/min）5 min。并于40 ℃水浴下氮气吹干，加入300 μL甲醇溶解，涡旋1 min，0.22μm微孔滤膜滤过，进行HPLC分析，进样量20μL，记录峰面积，按照公式计算峰浓度比值（Ce）^[12]、相对摄取率（RUE）^[13]和相对靶向率（RTE）^[14]。

Ce＝C_max(NLC)/C_max(溶液)

RUE＝AUC_NLC/AUC_溶液

RTE＝[AUC_{组织 (NLC)}/AUC_{总 (NLC)}－AUC_{组织 (溶液)}/AUC_{总 (溶液)}]/ [AUC_{组织 (溶液)}/AUC_{总 (溶液)}]

C_max(NLC)和C_max(溶液)分别表示药物纳米粒和药物溶液峰质量浓度；AUC_NLC和AUC_溶液分别表示药物纳米粒和药物溶液制剂在靶器官中的药时曲线下面积；AUC_组织表示同一制剂在靶器官中药时曲线下面积；AUC_总表示同一制剂在所有组织中的药时曲线下面积总和

2.2.5  方法学考察

（1）专属性：分别制备荷瘤小鼠空白血浆以及心、肝、脾、肺、肾和瘤组织空白匀浆液（不加入对照品溶液），含对照品的血浆和各组织匀浆液（空白血浆与空白匀浆液中加OA、UA与Rg₃对照品）及尾iv给药后血浆与各组织样品，按照“2.2.4”项下方法进行操作，进样20 μL，HPLC分析。在上述色谱条件下，方法的专属性好，所用色谱条件适宜，处理方法理想，生物样品中的内源性物质不影响OA、UA、Rg₃ 3个成分的检测，适合本研究中生物样品的分析。

（2）标准曲线：精密吸取OA、UA与Rg₃系列对照品溶液200 μL，置于4 mL离心管中，分别精密加入心、肝、脾、肺、肾和肿瘤的空白组织匀浆液及空白血浆100μL，涡旋混合1 min后，按“2.2.4”项下方法处理。进样20 μL，记录色谱图。分别以OA、UA与Rg₃峰面积为纵坐标（Y），以各自的质量浓度C（μg/mL）为横坐标（X），用加权最小二乘法进行线性回归运算，求得标准曲线方程，见表1，OA在5.04～130.10 μg/mL、UA在5.03～130.78 μg/mL、Rg₃在4.01～150.30 μg/mL质量浓度与峰面积均呈现良好的线性关系。

（3）精密度：取大鼠空白血浆100 μL，分别加入适量的OA、UA与Rg₃对照品溶液，配制成OA低、中、高3个质量浓度（5.04、20.16、100.08 μg/mL），UA低、中、高3个质量浓度（5.03、20.12、100.60 μg/mL）与Rg₃低、中、高3个质量浓度（4.01、16.04、80.20 μg/mL）的样品溶液，涡旋混匀后12 000×g高速离心，上清液采用HPLC测定OA、UA与Rg₃的含量，1 d内连续测定5次，连续测定3 d。计算日内、日间精密度。结果显示，OA低、中、高3个质量浓度样品的日内精密度RSD分别为3.27%、4.26%、3.64%，日间精密度RSD分别为3.93%、4.90%、3.86%；UA的日内精密度RSD分别为4.02%、2.39%、2.86%，日间精密度RSD分别为4.83%、3.01%、3.28%；Rg₃的日内精密度RSD分别为3.29%、4.30%、2.37%，日间精密度RSD分别为4.27%、4.88%、3.02%，符合生物样品方法学的测定要求。

（4）稳定性：分别取上述低、中、高3个质量浓度的样品溶液，考察在室温放置6 h，4 ℃冷藏条件放置24 h，−20 ℃冰箱中放置24 h，取出在室温下自然融解，完全融化后再放置于−10 ℃条件下测定样品中OA、UA与Rg₃的含量，评价不同条件下稳定性。在稳定性实验中不同条件下样品溶液中OA、UA与Rg₃含量的RSD均小于10%，提示OA、UA与Rg₃血浆样品溶液在室温放置6 h、4 ℃冷藏24 h和冷冻贮存条件下具有良好的稳定性。

（5）加样回收率：取大鼠空白血浆100 μL，分别加入适量的OA、UA与Rg₃对照品溶液，配制成OA低、中、高3个质量浓度（5.04、20.16、100.08 μg/mL），UA低、中、高3个质量浓度（5.03、20.12、100.60 μg/mL）与Rg₃低、中、高3个质量浓度（4.01、16.04、80.20μg/mL）的样品溶液，涡旋混匀后12 000×g高速离心，取上清液20 µL进样检测并记录峰面积，根据标准曲线方程计算样品的含量，将样品实测质量浓度与理论质量浓度进行比较，计算方法回收率。另精密移取低、中、高3个浓度OA、UA和Rg₃对照品溶液直接进样，记录峰面积，将样品的峰面积与上述对照品溶液的峰面积进行比较，计算提取回收率。结果显示，各质控样品OA方法回收率为89.67%、92.23%、94.32%，RSD分别为4.46%、4.32%、2.97%；UA方法回收率为89.45%、93.63%、92.19%，RSD分别为4.98%、3.26%、2.79%；Rg₃方法回收率为97.94%、92.18%、89.97%，RSD分别为4.32%、3.82%、4.93%，RSD均小于5%。

OA提取回收率为87.31%、90.25%、86.72%，RSD分别为4.34%、4.21%、3.96%；UA提取回收率为90.02%、87.74%、89.27%，RSD分别为4.17%、4.33%、4.18%；Rg₃提取回收率为88.06%、89.95%、90.28%，RSD分别为4.40%、3.28%、4.09%，RSD均小于10%。符合生物样品定量分析的相关要求。

2.3  激光共聚焦实验

在OUR-NLC和HA-NUR-NLC中加入荧光探针FITC，制备得到FITC-OUR-NLC、FITC-HA- OUR-NLC纳米粒。荷瘤小鼠18只，随机分为3组，即对照组（FITC溶液）、FITC-OUR-NLC组和FITC-HA-OUR-NLC组。给药前小鼠禁食不禁水12 h，ip 2%戊巴比妥钠（0.1 mL/20 g）深度麻醉，待麻醉后，尾iv给药，给药剂量为10 mg/kg（以OUR计）。

在小鼠肝脏部位做微创手术，将共聚焦显微镜探针置于肿瘤及肝脏处，各实验组在60、90、120、150、180、240 min实时拍照。

2.4  活体成像实验

在OUR-NLC和HA-NUR-NLC中加入荧光探针DiR，制备得到DiR-OUR-NLC、DiR-HA-OUR- NLC纳米粒。荷瘤小鼠18只，随机分为3组，即对照组（DiR溶液）、DiR-OUR-NLC组和DiR-HA-OUR-NLC组。给药前小鼠禁食不禁水12 h后，ip 2%戊巴比妥钠（0.1 mL/20 g），待麻醉后，尾iv给药，放置于活体成像仪中，各实验组在10 min及0.5、1、2、3、12 h实时拍照。拍摄模式为荧光模式，激发波长760 nm，发射波长700 nm，曝光时间为7 s。

3  结果

3.1  HA-OUR-NLC对OA、UA和Rg₃在荷瘤小鼠各组织中分布的影响

OUR、OUR-NLC和HA-OUR-NLC给药后各时间点小鼠血浆、心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤中OA、UA和Rg₃水平变化结果见图1～3。结果可知，HA-OUR-NLC组小鼠OA、UA和Rg₃质量分数在肿瘤中最高，其次为肝脏，心脏中最低。OUR-NLC组小鼠各组织中OA、UA和Rg₃质量浓度均高于OUR组，且衰减时间有所延长。与OUR-NLC比较，HA-OUR-NLC的肿瘤靶向性更明显，且肝、肾的含药量略有降低。HA-OUR-NLC给药后经体循环快速富集于肿瘤和肝脏，而在血液和其他组织中分布较少。HA-OUR-NLC组在肿瘤的药物蓄积增加，推断HA可能与肿瘤细胞表面受体CD44特异性结合，介导药物转运入胞，从而增加了药物在肿廇中的蓄积。表2～4结果表明，HA-OUR-NLC组小鼠OA、UA和Rg₃在肿瘤中Ce分别为2.99±0.85、3.11±0.50、3.12±0.32。RUE分别达到2.51±1.23、2.27±1.43和2.77±0.25，表明经过HA修饰的纳米粒可增强药物在肿瘤中的摄取。RTE分别达到（5.60±1.62）%、（5.24±0.32）%和（5.07±1.43）%。

3.2  激光共聚焦实验

由图4可知，给药60 min后FITC溶液组没有荧光，未见肿瘤细胞以及肝细胞轮廓，FITC-OUR- NLC、FITC-HA-OUR-NLC组肿瘤和肝脏细胞轮廓清晰，因此，排除了游离FITC对测定的干扰。

由图5可知，给药60 min时FITC-HA-OUR- NLC主要分布在细胞间，90 min时向内移动到细胞膜内侧，当给药120 min时，FITC-HA-OUR-NLC进入到了细胞内部开始大量聚集，在240 min后，FITC-HA-OUR-NLC在细胞内大量消散，视野模糊。由此可见，FITC-HA-OUR-NLC可以递药于细胞内。与FITC-OUR-NLC相比，FITC-HA-OUR-NLC随着时间的延长，在肿瘤部位的荧光强度增强，纳米粒由细胞外逐渐进入到细胞内部，数量亦逐渐增加，说明纳米粒进入细胞内的数量与时间呈正相关性。结果表明，经HA修饰后，HA-OUR-NLC能更好地进入肿瘤细胞内部，体现了其主动靶向肿瘤细胞的特性。

3.3  活体成像实验

不同实验组各时间点成像如图6所示，DiR- HA-OUR-NLC组可以明显地在肿瘤区域观察到较强的荧光信号，3 h在肿瘤部位的蓄积量最大，而DiR-OUR-NLC组只观察到明亮的全身信号，肿瘤部位较弱。

4  讨论

HA具有高效的肿瘤靶向特异性，在赋予药物载体靶向性以及自身作为药物载体等方面有重要的应用。细胞表面表达的CD44是HA最重要的受体之一，CD44表达量较高的细胞表现出对HA更高的摄取效率。肿瘤细胞表面相对正常细胞更多地表达CD44分子，通过CD44介导的细胞内吞作用，从而使肿瘤细胞能够更多地特异性摄取纳米脂质载体。HA作为靶向肿瘤的药物载体，主要依靠受体介导的细胞内吞作用，实现在靶标细胞部位的药物浓度增加，实现靶向治疗^[11]。本研究选用人参中对抑制肿瘤确有疗效的难溶性有效成分UA、OA、Rg₃，将3个成分包载在纳米脂质载体中，从而达到延长循环时间、改变药物在体内分布、提高药效和降低副作用的目的。采用HA作为靶向因子，经电荷吸附作用对纳米脂质载体进行靶向修饰，实现主动靶向肿瘤的目的。

在进行动物体内的相关研究时，通常需要将动物进行活体解剖取材，无法对活体进行长时间重复性的观察^[15]。近年来，活体生物荧光成像技术（optical in vivo imaging，OIVI）的出现使得这一难题得到了很好的解决。DiR是一种亲脂性近红外荧光染料，可用于实时观察制剂在体内的迁移和分布。之所以选择近红外的荧光染料，是为了减小动物内源性物质及皮毛对测定的干扰。将DiR包载于内部，尾iv给药，考察制剂的靶向性。

本研究以小动物活体成像仪考察了HA-OUR- NLC对荷瘤小鼠的肿瘤靶向性效果。结果显示，与DiR-OUR-NLC相比，DiR-HA-OUR-NLC主动靶向于荷瘤小鼠的肿瘤部位，并在给药后3 h达到高效富集。进一步验证经HA修饰的纳米脂质载体具有良好的肿瘤靶向效果，符合预期设想。

来  源：孙  爽，尚尔雨，肖洪彬，赵程程，郭玉岩，李永吉，杨大宇，吕邵娃. 透明质酸修饰的包载人参中3种成分纳米脂质载体抗肿瘤活体靶向与组织分布研究 [J]. 中草药, 2019, 50(17):4209-4218.

来源：中草药杂志社