大家好，今天给大家分享一篇Nature上的文章，通讯作者Jason W.Chin，英国 Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology，研究领域涉及模式生物中遗传密码子扩增，光遗传学，蛋白质的化学标记，翻译系统重编程等，Martin Schmeing, 加拿大 McGill University，主要利用X-ray，电子显微镜和生物化学技术对超大分子机器的结构和功能进行研究，重点关注核糖体和非核糖体肽合成酶。

生物体中许多酶促反应都有一个酰基-酶复合物中间体形成，例如酯或者硫酯中间体，参与其中的酶包括丝氨酸水解酶，半胱氨酸水解酶和泛素化组分。它们的突出特点是酰基-酶复合物非常不稳定，易水解，因此限制了对其结构的研究。尽管利用非天然底物或者突变体能够改善这种情况，但这种明显非天然的改变可能会影响最终结构的解析。为了解决这一问题，作者们发展了一种非天然氨基酸，即2,3-diaminopropionic acid（DAP），结构与酶催化位点的半胱氨酸或丝氨酸非常类似，能够参与酶促反应的第一步并将底物捕获，生成稳定的酰胺键，从而进行结构解析。

作者首先从反应活性上进行了分析，发现DAP中β-氨基的pKa在6.3-7.5之间，具有较强的亲核性，可能与底物反应生成酰胺键，酰胺键的水解半衰期为500年，非常稳定，能够替代酯键或者硫酯键，而且结构非常类似；然而由于结构上的相近性，直接发展对应的非天然氨酰tRNA合成酶非常困难，作者设计了一些列带有保护基团的非天然氨基酸，引入蛋白质后，通过光照脱保护即可生成DAP，最后得到了非天然氨基酸6，能够有效的插入对应的蛋白质中。然后作者选取了一个典型的半胱氨酸水解酶，tobacco etch virus (TEV）protease，对设想体系进行验证。将催化位点C151替换成DAP，与Ub-tev-His6孵育，发现His6标签被成功切除，同时形成了TEV(C151DAP)-Ub复合物，并用质谱确定了交联位点，因此该结果证明DAP能够捕获水解中间体，形成稳定复合物，与设想一致。

最后，作者将DAP应用于了非核糖体肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases, NRPSs）体系中。NRPSs参与许多天然产物的合成，通过磷酸泛酰巯基乙胺化修饰末端的巯基介导的一系列小分子酰基化合物连接在一起，包括抗肿瘤化合物，抗生素，抗菌剂等，因此对该合成过程中酰基-酶中间体的研究显得非常重要。其中，最后一步是线性肽的聚合和环化，该步由位于NRPSs末端的thioesterase(TE)结构域控制，该步必须保证足够的快，否则会导致线性肽的直接水解生成副产物。作者在本文关注valinomycin的合成，该合成酶包括两个蛋白质，四个NRPS合成模块，将合成好的tetradepsipeptide中间体传递给TE结构域，进行聚合，生成dodecadepsipeptide等产物，然后环化并释放生成valinomycin，因此对该过程中酰基-TE结构域的中间体复合物结构的研究将有助于揭示TE结构域如何对该合成过程进行控制的。

上述的酶体系过于复杂，因此作者利用野生型TE对小分子底物进行筛选，发现N-acetylcysteine(SNAC)能够很好的模拟带有磷酸泛酰巯基乙胺化修饰结构域功能，并参与之后的催化合成步骤中，因此将体系进行了简化。

通过之后的实验进一步证实野生型TE和底物depsipeptidyl-SNACs不能形成稳定的复合物，因此，对催化位点S2463改造，引入DAP，首先通过质谱确定了能够生成稳定的中间体复合物，产率能够达到60%以上。

对该合成过程中多种状态下晶体结构进行分析，最终作者们发现dodecadepsipeptidyl-TE结构中催化口袋上方的结构域发生一系列重构，对底物的位置进行调整，最终将其置于催化口袋中，进行环化释放。

总之，本文作者发展了DAP体系，能够非常贴近的模拟酰基-酶中间体复合物结构，并生成稳定的复合物供后续结构和机理研究，将在其它类似体系中有广泛的应用。

文章作者：CN

文章引用：Trapping biosynthetic acyl-enzyme intermediates with encoded 2,3-diaminopropionic acid. Nature (2018) https://doi.org/10.1038/s41586-018-0781-z