分享一篇近期发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文献，题为：Dual Self-Promoted Ring-Opening Polymerization towards Cationic Polypeptoids with Stable Helices，该工作的通讯作者是来自苏州大学的张正彪教授。

    阳离子螺旋是普遍存在于多种生物体中的结构基序，在膜相互作用、蛋白质运输和免疫防御等生物过程中发挥重要作用。天然阳离子螺旋主要采用α-螺旋结构，含有赖氨酸和精氨酸等带电残基。然而，将带电残基引入多肽通常会破坏α-螺旋的稳定性，因为侧链静电排斥会破坏维持螺旋结构所必需的氢键。螺旋稳定性通常随带电残基数量增加以及阳离子基团与主链之间距离的减小而降低。例如，带正电荷的聚（L-赖氨酸）呈现无规卷曲构象（图1a），但在细胞穿透、基因传递和抗菌等应用中，螺旋结构通常比无规卷曲更具优势。

    为稳定阳离子多肽的α-螺旋结构，研究引入了长带电侧链，使带电部分远离主链（图1b），从而显著降低螺旋表面的电荷密度，避免电荷排斥破坏螺旋结构。此外，侧链的疏水性也至关重要：只有当侧链足够长且疏水，且电荷距离主链11个σ键时，才能显著稳定α-螺旋。然而，疏水性的增强与正电荷结合会显著增加细胞毒性。

    聚类肽作为多肽的结构类似物，其取代基从α-碳原子转移到氮原子上，这一变化消除了主链的手性中心和氢键供体，阻止了多肽中常见的强氢键相互作用。此外，与多肽中酰胺主要呈反式构象不同，聚类肽的三级酰胺因顺/反构象能量接近而易发生构象转换。缺乏分子内氢键以及顺/反异构化的存在，导致聚类肽主链具有固有的灵活性，难以折叠成螺旋等刚性二级结构。已有报道的策略旨在控制聚类肽的顺/反酰胺异构化，以使其主链刚性化（图1c）。一种常见的方法是通过使用极大体积的α-支链侧链来诱导顺式酰胺构象以最小化了与反式构象相关的空间相互作用。不同于通过N-H-O分子内氢键和侧链疏水相互作用稳定的α-螺旋，类肽中观察到的这些类PPI螺旋构象主要由侧链的空间位阻稳定。另一种方法涉及引入阳离子侧链，如三唑鎓、烷基吡啶鎓、和季铵侧链，通过主链羰基与带电侧链部分之间的静电和氢键相互作用来诱导顺式酰胺构象，然而，这些阳离子肽不能形成螺旋结构。

    在本篇工作中，作者通过可控开环聚合高效合成了带有大体积、手性叔胺侧链的聚类肽（图1d），聚合不仅存在侧链介导的质子转移和螺旋诱导加速的双重自促进机制，还形成了与聚脯氨酸类似的类PPI螺旋，不同的是，该聚类肽具有良好的水溶性。

图1. a) 由于带电侧链的静电排斥破坏了α-螺旋稳定性所必需的氢键，L-PLys 采用无规卷曲结构。b) 通过延长侧链以降低表面电荷密度并增强侧链间的疏水相互作用来稳定多肽的α-螺旋。c) 通过使用特殊侧链促进顺式酰胺构象来刚性化聚肽主链。d) 通过双自促进ROP高效合成阳离子类PPI螺旋聚类肽。该类PPI螺旋聚类肽通过空间约束以及侧链与主链之间的 C-H···O氢键被阳离子侧链稳定。

    首先作者合成了带有手性叔胺侧链的N-取代N-羧酸酐（NNCA）单体，原位生成的HCl质子化了叔胺侧链，形成叔胺盐酸盐单体，可以从反应混合物中沉淀出来。

    随后在氯仿中实现了单体的聚合（图2a），加入等摩尔三乙胺去质子化以增加溶解度，反应呈现为活性聚合，通过调节初始单体与引发剂浓度比（[M]₀:[I]₀）可以很好地控制聚合物的分子量（M_n）（图2b），在聚合过程中，M_n随单体转化率呈线性增加，而分子量分布保持较窄（Р<1.2）（图2c），单体加入后成功的链延伸进一步支持了聚合的活性特征（图2d），聚合物的 MALDI-Tof-MS 谱图显示聚合物具有良好的端基保真度。尽管存在显著的空间位阻，作者观察到了单体能够非常迅速的聚合。

图2. a) ROP 合成方案及单体化学结构。b) 不同DP下L-P1的SEC曲线。c) L-M1的 ROP 过程中M_n和Ð随单体转化率变化的曲线（[M]₀:[I]₀:[TEA]₀= 50:1:50）。d) 链延伸前后L-P1 的 SEC 色谱图。e) L-P1 (DP=25) 的 MALDI-Tof-MS 谱图。

    为了探究聚合机制，作者对一系列结构相关的单体进行动力学研究，通过使用DFT计算方法优化了这些单体的空间填充图，还获得了相应仲氨基增长链末端的空间填充图，使用埋藏体积（%Vbur）来表示单体在氮原子周围的立体环境，L-M1 显示出最高的空间位阻，%Vbur为36.1%（图3a），但出乎意料地表现出最快的聚合动力学，所得 L-P1的CD 光谱在 210 nm 附近显示最大正吸收带，在195nm和225nm 之间有两个负吸收带，表明其具有类PPI螺旋结构。相比之下，尽管存在手性叔胺侧链，所得的L-P2、L-P3和L-P4采用了更无序的结构（图3f），因此，L-M1的快速聚合可能是由于所得聚合物链的刚性螺旋结构，增强了增长链末端与单体相互作用的可及性。

    同时对映体L-M1和D-M1表现出相当的聚合速率，比外消旋单体聚合更快（图3b），相应的对映体的均聚物CD光谱也呈镜像，而外消旋对应物无CD信号，为了研究叔胺侧基的作用，作者尝试了L-M6和L-M7的聚合，二者具有与L-M1相似的位阻，所得的聚合物也采用类PPI螺旋结构（图3a,g），但聚合速率显著更慢。L-M1和M5之间聚合速率的差异也能说明，具有环己基侧链的非手性M5比在邻位含有一个额外叔胺基团、空间位阻更大的L-M1要慢得多（图3d）。这些动力学研究表明了L-M聚合的双自促进机制：聚合物链的刚性螺旋主链促进和侧链上的叔胺基团促进。

图3. a) 通过 DFT 计算方法（BP86）优化的L-M1到L-M7的空间填充图。b) L-M1、D-M1和L-M1 + D-M1的动力学研究图。c) L-M1、L-M2、L-M3 和L-M4的动力学研究图。d) L-M1、M5、L-M6和L-M7的动力学研究图。e) L-P1、D-P1 和rac-P1在水（pH = 3）中的CD谱图。f) L-P1在水（pH = 3）中、L-P6在乙腈中和L-P7在甲醇中的CD谱图。

    随后作者通过DFT计算验证了L-M1侧链上原位生成的叔胺基团通过与其仲氨基增长链末端的分子间氢键作用自促进其聚合（图4）。通过位阻较小的八元环过渡态TSa1 (29.9 kcal/mol) 的路径A的活化能显著低于通过约束更大的四元环过渡态TSc1 (36.6 kcal/mol) 的路径C的活化能。这表明伴随着协同的亲核加成-消除过程的路径A更为有利。在路径 A 中，在TSa中清楚地观察到L-M1与增长链末端1之间的分子间氢键，随后从增长链末端1到L-M1的叔胺侧链的质子转移产生了一个两性离子中间体INTa1，该中间体进一步经历快速的质子转移到邻近的氮原子，同时释放出CO₂，该过程中叔胺侧链充当质子转移穿梭器，促进了协同的亲核加成-消除过程。对化合物2（增长链末端的简化结构模拟物）的¹H NMR分析显示，随着浓度增加，仲氨基质子的化学位移向低场移动（图5），说明链末端会产生氢键，但也无法排除通过分子内氢键的五元环过渡态TSb1的路径B。

图4. 叔胺侧链L-M1模型链的增长反应的DFT计算。

图5. 化合物2在CDCl₃中浓度逐渐增加的¹H NMR谱图

    随后作者测定了聚合物螺旋的稳定性，当温度从20°C升高到90°C，pH值从1.7增加到7.0时，L-P1 的螺旋结构几乎不受影响（图6a,b），且对强变性剂（包括盐酸胍（GdnHCl）和尿素）表现出显著的抵抗性（图6c），作者通过化合物3（聚合物链模拟物）的两种构象的N末端甲基质子峰的¹H NMR峰积分，确定了 K_cis/trans比率，在水溶液中约为2.5，并且在 pH 2到7的范围内几乎恒定（图6d）。DFT计算表明化合物 4（L-P1中酰胺结构的简化模拟物）在反式构象中的能量最小化结构显示出比顺式高2.049 kcal/mol，表明顺式构象在热力学上更有利（图6e）。

图6. a, b) L-P1在水（pH = 3）中在不同温度和pH值下的CD谱图。c) L-P1在水（pH = 3）中在25°C下，存在不同浓度尿素时的CD谱图。d) 化合物3的K_cis/trans随D₂O中pH值变化的曲线图。e) 通过DFT计算得到的化合物4的能量最小化顺式和反式酰胺结构。

    为了拓展应用场景，作者对L-P1进行功能化修饰，有烷基、苄基、可点击炔基、羧基、磷酸酯和磺酸酯基团的多种季铵聚类肽（图7a），¹H NMR表明实现了定量转化。与多肽中阳离子侧链通过静电排斥诱导螺旋破坏不同季铵化的聚类肽尽管带有靠近主链的带电侧链，却保留了螺旋结构，且螺旋性显著增强（图7b, c），CD光谱证明后修饰产物同样具有良好的热稳定性（图7d），这可能是修饰的乙基，增加了位阻，且在主链羰基氧原子与季铵侧链之间形成的额外 C-H-O氢键增强了K_cis/trans比率，为了支持该假设，对化合物6（L-P1-Et中酰胺结构的简化模拟物）进行了DFT计算（图 7e），顺式构象能量显著更低，同时观察到了在羰基氧原子与季铵侧链中乙基的β-质子之间存在一个额外的氢键，化合物6的静电势表面（EPS）图显示了乙基上α和β质子的正电性证实了氢键形成的可能性。通过DFT 模拟获得了具有5个重复单元的 L-P1-Et 模型。该低聚类肽表现出与L-P1-Et 相似的CD谱图。能量最小化模型显示了一个右手类PPI螺旋，其螺距（8.37 Å）比L-P1（6.40 Å）更宽，螺旋更为伸展。

图7. a) L-P1 的季铵化。b-c) L-P1-neutral、L-P1-charged 和 L-P1-Et (DP=25) 分别在TFEA和Milli-Q水中，25°C下的CD 谱图。d) L-P1-Et在Milli-Q水中温度升高时的CD谱图。e) 通过 DFT 计算得到的化合物6的能量最小化顺式酰胺结构。f) 化合物6在顺式酰胺结构中的相应EPS图（红色表示正电势，颜色强度与电势大小成正比）。g, h)通过DFT计算得到的L-P1-Et和L-P1-neutral具有5个重复单元的能量最小化模型。

    随后作者使用A549细胞（肺癌人类肺泡基底上皮细胞）评估了该聚类肽的细胞毒性，与聚L-赖氨酸（L-PLys₂₅）（IC₅₀= 92 µg/mL）相比L-P1₂₅（IC₅₀= 354 µg/mL）和L-P1₂₅-Et（IC₅₀>1024 µg/mL）表现出更低的毒性，即使链长从50 DP延长到100 DP，细胞毒性仍然相对较低(IC₅₀=466和331 µg/mL)，（图8a）这可能由于叔铵和季铵基团的取代基导致更离域的表面电荷，从而减少了与细胞膜的静电相互作用。

    阳离子螺旋结构在控制细胞穿透肽（CPPs）的跨膜能力方面起着关键作用。将L-PLys₂₅，L-P1₂₅-Et，L-P1₂₅末端用罗丹明B（RhB）标记，并在A549细胞中研究了其摄取动力学（图8b），观察到L-P1₂₅具有更快的摄取速率，2小时内迅速发生，之后水平趋于稳定共聚焦荧光显微镜图像进一步证实了L-P1₂₅的有效细胞摄取，清楚地显示了RhB标记的L-P1₂₅在细胞内的荧光（图8c）。L-P1₂₅比L-P1₂₅-Et更高的细胞摄取可能源于表面电荷密度和疏水性之间的最佳相互作用，因此可通过进一步调节电荷密度和疏水性，从而在保持相对较低细胞毒性的同时，实现增强的细胞摄取效率。

图8. a) 用 L-PLys₂₅、L-P1₂₅、L-P1₅₀、L-P1₁₀₀和L-P125-Et处理A549细胞的细胞活力。b)L-PLys25、L-P125和L-P125-Et 在A549细胞中以10 µM浓度随时间变化的摄取情况。c)A549细胞与L-P125、L-P125-Et和L-PLys25一起孵育的荧光图像。细胞核在蓝色通道中可见；细胞内的聚合物在红色通道中可见；Merge代表蓝色和红色通道的叠加。

    总之，阳离子聚类肽的快速双自促进聚合，结合结构多样性和显著的螺旋稳定性，为开发更先进的功能性螺旋聚合物提供了启示。此外，这些水溶性的、高度坚固的螺旋阳离子聚类肽在各种应用中具有巨大潜力。例如，它们可用作自组装中的刚性、亲水链段，以构建独特的结构。同时，低细胞毒性和高细胞摄取效率使它们成为设计新型细胞穿透、基因传递和抗菌剂材料的理想候选者。

作者：TCM

DOI: 10.1002/anie.202521129