分享一篇发表在Nat. Chem.上的文章，文章的题目是“Global profiling oflysine reactivity and ligandability in the human proteome”，通讯作者是来自Skaggs 化学生物学研究所和 Scripps Research 化学生理学系主任Benjamin F. Cravatt。其课题组致力于了解蛋白质在人类生理和病理过程中的作用，并利用这些知识确定治疗疾病的新靶点和药物。
亲核氨基酸对蛋白质功能做出重要贡献，包括在催化中发挥关键作用和作为翻译后修饰的位点。小分子可以作为多功能探针来扰乱蛋白质在生物系统中的功能，并且是治疗人类疾病的治疗剂的主要来源。尽管如此，大多数人类蛋白质仍然缺乏选择性化学配体，某些类别的蛋白质甚至被认为是不可成药的。共价配体提供了一种扩展适合小分子靶向的蛋白质范围的策略。在蛋白质氨基酸中，赖氨酸代表了共价配体开发的潜在有吸引力的候选者，因为赖氨酸 ε-胺本质上是亲核的，并且赖氨酸存在于许多功能位点，包括酶活性位点和介导蛋白质 - 蛋白质相互作用的界面。1. 作者首先通过“isoTOP-ABPP”（同位素串联正交蛋白水解活性基于蛋白质分析），用于测量天然蛋白质组中的半胱氨酸反应性(图1)，并确定胺反应性戊炔酸磺基四氟苯基酯作为STP-炔烃1探针，对人类蛋白质组中的赖氨酸残基显示出广泛的反应性和良好的选择性。图1：通过 isoTOP-ABPP 进行赖氨酸反应性分析的通用方案，同位素比率（R 值）反映了轻样品与重样品中 1 标记肽的相对 MS1 色谱峰强度。2. 随后，作者在对人类细胞蛋白质组中赖氨酸反应性的定量分析过程中，发现检查的每种蛋白质都显示出被活化酯探针的强烈标记，并且在许多情况下，这些探针中的一个或多个的标记通常被阻断完全，通过将高反应性赖氨酸突变为精氨酸（图2），强调了这些残基的异常高反应性。高反应性赖氨酸的突变会阻断 NUDT2（一种与癌症和免疫细胞代谢有关的四磷酸二腺苷水解酶）和 G6PD（磷酸戊糖途径酶葡萄糖 6-磷酸 1-脱氢酶）的催化活性并降低 PFKP（血小板型磷酸果糖激酶）的活性，但值得注意的是，虽然在所有主要类别的蛋白质上都发现了高反应性赖氨酸，其分布与反应性较低的赖氨酸相似，但是与反应性较低的赖氨酸相比，高反应性赖氨酸不太可能被泛素化。图2：高反应性赖氨酸由活化的酯探针进行位点选择性标记。3. 接下来作者以“竞争性”形式应用 isoTOP-ABPP 来评估赖氨酸的配体能力（图 3）, 那些片段敏感的赖氨酸与DMSO 对照相比, 在存在一个或多个片段时富集（对于DMSO/片段，R ≥ 4）是被确定为显着减少 (≥75%) 的。作者总共在 113 种蛋白质中鉴定了 121 种配体赖氨酸，具有配体赖氨酸的非药物银行蛋白的突出亚群包括转录因子和支架蛋白，它们被认为对小分子靶向具有挑战性。同时反应性赖氨酸显示出更大的配体能力，并且只有一小部分（~20%）具有配体赖氨酸的蛋白质被发现含有配体半胱氨酸。图3：竞争性 isoTOP-ABPP 的通用技术方案。配体能力比或 R 值是通过量化 DMSO（重或蓝色）与片段处理（轻或红色）样品中 1 标记肽的相对 MS1 色谱峰强度来测量的.≥4 的 R 值用于定义定量赖氨酸的片段配体事件.4. 之后，作者通过开发一个基于 MS 的定量平台来确认片段 - 赖氨酸加合物，该平台同时测量单个蛋白质中赖氨酸的片段亲电修饰以及这些反应的部分占有率和特异性（图4）。结果发现了六种测试蛋白质的高平均序列覆盖率 （>40%）（PFKP、PNPO、HK1、HDHD3、XRCC6 和 SIN3A）以及表明配体赖氨酸由 isoTOP-ABPP 指定的被相应的亲电片段直接加成，并且由赖氨酸裂解事件产生的其他胰蛋白酶肽不受片段亲电试剂处理的影响，表明片段与测试蛋白质上的单个赖氨酸反应的特异性。图4：通过定量蛋白质组学直接测量蛋白质上赖氨酸片段反应的工作流程示意图。5. 最后，作者在确定 isoTOP-ABPP 绘制的片段-赖氨酸相互作用的功能影响时，发现片段 19 阻断了 PNPO 中 K100 的探针标记，其表观最大半数抑制浓度（IC50）值为 3 μM；片段 49 以 2 μM 的表观IC50 阻断了 NUDT2 的探针标记；片段20以 2 μM 的表观 IC50 阻断重组 PFKP 的探针标记，且片段 20 对WT-PFKP 催化活性的抑制在底物周转减少约 80% 时趋于稳定（图5a-c）。片段 21 与 SIN3A （一个多域 145 kDa 转录抑制因子，参与组蛋白脱乙酰酶调节和抑制MYC 反应基因）中的 K155 结合（图 5e），但在其他方面显示低蛋白质组反应性，同时证据表明靶向 SIN3A 中 K155 的共价配体可以在药理学上破坏与基因调控有关的蛋白质-蛋白质相互作用的选定子集。图5：a-c:代谢酶中靶向活性位点（PNPO (a) 和 NUDT2 (b)）和变构 (PFKP) (c) 赖氨酸的片段以浓度依赖性方式阻断酶活性，表观 IC50 值与基于凝胶的 ABPP 测量的值相当 使用赖氨酸反应探针（探针标记）.e:片段 21 (50 μM) 完全竞争探针 1 标记 SIN3A 的 K155. 作者描述了一个定量化学蛋白质组学平台，以全局绘制人类蛋白质组中赖氨酸残基的反应性和配体性，以此推测显示出更高反应性的赖氨酸的更广泛的功能影响。同时，开发和评估更大的化合物库，显示更多样化的识别和胺反应元素，包括共价可逆亲电试剂（例如醛），结合调查互补细胞类型，极大地丰富了我们对人类蛋白质组中功能性和可配体赖氨酸的理解，并通过这样做扩展了其可用于基础和转化研究目标的药物范围。原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5726523/原文引用：doi.org/10.1038/nchem.2826
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