今天给大家分享一篇利用肟作为一类新的光不稳定笼基制备了一系列可光活化的探针。本文的通讯作者是Rice University的Xiao Han教授，教授主要从事生物分子的精密修饰，下一代抗体疗法以及免疫细胞工程等研究。

      肟基团被用作荧光猝灭剂，由于其小尺寸和弱吸电子特性，它通过削弱荧光团的内部电荷转移 (ICT) 过程来发挥作用，在本文中，作者使用肟基团制备了可光活化的荧光团，该荧光团经历了由可见光触发的新型光活化过程。在各种荧光团支架内羰基的肟取代削弱了 ICT 过程，导致荧光减弱。用可见光激发会导致生成的肟笼荧光团与分子氧发生 [2 + 2] 环加成反应，然后使用经典的“推拉”ICT 系统自发分解为荧光团。该策略用于不同细胞器的活细胞成像以及与基因编码标记技术相结合的目标蛋白质的超分辨率成像。

      作者根据文献中的方法合成了ACD-Oxm 1。DMSO 中的 ACD-Oxm 在 262 nm、300 nm 和 383 nm 处表现出三个最大值，并伴有非常弱的荧光。与其羰基对应物ACD2相比，ACD-Oxm 的吸收光谱从 400 nm延伸到450 nm，表明使用 430 nm 光实现有效的光活化。通过1H NMR 和 ESI-MS 分析来表征证实了 ACD-Oxm 的可见光光活化恢复了 ACD 的酮结构。

      作者将设计的策略扩展到其他常用的荧光团，合成了多种具有不同支架的染料，均有类似的效果。为了研究肟笼荧光团中荧光猝灭的机制，对 ACD-Oxm 和 ACD 的优化结构进行了时间依赖密度泛函理论 (TD-DFT/B3LYP) 计算。 ACD-Oxm 的HOMO和LUMO遍布整个 ACD-Oxm 结构，表明该分子中的 ICT 效应非常弱。ACD HOMOs 和 LUMOs 分别主要位于羰基区域和苯共轭结构中，表明在可见光照射下具有强 ICT 效应和强荧光发射。

       作者研究了溶剂效应并使用 ACD-Oxm进行了对照实验。 ACD-Oxm 在甲苯、乙腈、DMSO和 t-BuOH中的光活化，产率分别为78%、71%、85% 和 80%，表明溶剂对光活化反应没有明显影响。在黑暗中没有检测到活化产物，证实光照射是促进这种转变所必需的。在没有氧气的情况下没有观察到活化产物，同位素分析显示 H2O 不参与光活化。使用近红外磷光法检测在空气饱和的甲醇中激发 ACD-Oxm 后单线态氧的产生，表明单线态氧不参与它们的光活化。添加 TEMPO 显着抑制了肟笼荧光团的光活化，表明自由基参与了光解过程。在自由基引发剂AIBN存在下，ACD-Oxm 在 80°C 的黑暗中发生活化，以 80% 的产率产生 ACD。作者提出了一种用于肟笼荧光团光活化的机制。当被光照射时，肟笼荧光团被激活为中间双自由基物质 A*。随后，自由基部分被溶解氧氧化产生 B,其解离产生羰基化合物 C。

      随后作者对肟笼探针在水性缓冲液中的稳定性、pH 敏感性和光活化效率进行了考察。肟荧光团显示出出色的稳定性，同时BAD-Oxm 表现出极好的光稳定性和可忽略的光毒性。BAD-Oxm 被用于活细胞共聚焦成像，在BAD-Oxm 的细胞内光活化实验中，观察到荧光增强了 22倍，以及非常低的细胞自发荧光和可忽略的背景信号。

      作者接着探索了肟笼策略在细胞器靶向荧光成像中的应用。通过上图所示合成化合物，所有三种细胞器靶向探针在黑暗中都表现出较好的稳定性，并且通过 DMSO/PBS中的光活化可以诱导超过 90 倍的荧光增强。然后使用共聚焦激光扫描显微镜来确定三种荧光团各自定位到活细胞中的内质网、线粒体和溶酶体的能力。共定位实验证实，BAD-Oxm 化合物的荧光与相应的商业细胞器特异性染料表现出良好的共定位。

      最后作者使用肟笼荧光团对 HaloTag 蛋白进行超分辨率成像，作者合成了 BAD-Oxm-Halo 26并在 PBS 缓冲液/DMSO 溶液中评估了其特性。BAD-Oxm-Halo 小分子及其标记的蛋白质在蓝光照射下分别显示出 103 倍、80 倍的荧光增强。作者对活的 CHO-K1 细胞中的组蛋白2B进行了 PALM 成像。从 20000-30000 个成像帧获得的组蛋白 2B 蛋白的重建图像与相应的宽视野图像相比，分辨率显着提高（平均定位精度为 55.7 nm）。该结果证明了在生理条件下无需添加有毒增强剂即可使用肟笼式荧光团进行 PALM 成像。因此基于肟的荧光团具有用于特定标记现有蛋白质的扩展功能，从而为活细胞中的超分辨率成像提供了巨大的潜力。

文章引用：DOI: 10.1039/D1SC05351E