论文DOI：10.1021/acscatal.1c00587本文利用可溶性多孔亚胺分子笼（IMCs）制备了一种半非均相金属-酶集成催化剂，该催化剂在加热条件下可部分溶解于有机溶剂，在室温下可完全沉淀回收。亚胺分子笼在催化剂制备和催化反应中起着重要的作用：（3）创造碱性疏水微环境，提高反应的选择性和催化效率。本文首次利用亚氨键通过Ugi反应共价固定化酶，并研究酶固定化机理及其构效关系。该半非均相催化剂在伯胺的动态动力学拆分（DKR）中展现出优秀的催化活性、选择性和重复使用性。
▲Scheme 1. Formation mechanism and process of the metal-enzyme catalyst
如Scheme 1所示，以亚胺分子笼CC3作为稳定剂和载体，使用甲醇作为还原剂将Pd(OAc)2还原为超细Pd金属纳米粒子（PdNPs）。随后利用CC3上的亚氨基通过Ugi反应实现酶的固定化，完成金属-酶集成催化剂的合成。▲Figure 1. (a-d) TEM images of Pd@CC3; (a’-d’); Particle-size distribution of PdNPs; (e) HAADF-STEM image of Pd@CC3; (f-h) Elemental mappings of the Pd@CC3.
▲Figure 2. The XRD pattern (a, b), XPS spectrum (c), C1s core level peak (d), N1s core level peak (e) and Pd3d core level peaks (f) of Pd@CC3.
透射电镜图像清楚的显示出PdNPs的形态和粒径。通过控制金属前体的加入量实现对PdNPs粒径的调控，金属前体的浓度越大负载量越大，但粒径也越大。当前体浓度为0.5 mM时，PdNPs的平均粒径能达到1.8 nm。考虑到PdNPs的大小与分子笼的大小（最大直径=2 nm）相近，可以认为Pd纳米粒子占据了CC3晶体结构内一个CC3分子的位置。XRD图谱显示Pd为面心立方晶型，各衍射峰所对应的位置与钯（JCPDS01-1190）的标准卡片一致。XPS证明了CC3的完整与PdNPs的成功合成。PdNPs越小，二价钯含量越大，催化活性越高。▲Figure 3. (a) FTIR spectra of CALB, Pd@CC3 and Pd@CC3@CALB; (b) XRD patterns of CC3, Pd@CC3 and Pd@CC3@CALB; (c) TEM image Pd@CC3@CALB; (d, e) Elemental mappings of the Pd@CC3@CALB.
▲Figure 4. (a, b) Immobilization process and activity recovery of CALB at different concentrations of t-butyl isocyanide; (c, d) Secondary structure of CALB before(c) and after (d) immobilization from Amide I region analysis; (e) hydrophobic amino acids in α-helix 5 and α-helix 6; (f) α-helix 5 and α-helix 10 (blue) in CALB and the amino acid residues Asp-145 (brown) and Lys-290 (violet) in monomer open conformation.
红外图谱证明了酶通过Ugi反应成功固定在了CC3上；XRD图谱说明Pd与酶的集成不会影响CC3本身的晶体结构，这验证了固定化后CC3晶体中窗对窗通道结构的完整。Pd与S元素的Mapping图展示了两种元素在催化剂上的分布情况，其中S元素来自于酶中的含巯基氨基酸，这再次证明了Pd与酶的成功固定。固定化进程曲线与酶活回收曲线验证了异氰酸酯作为Ugi反应中的必须组分在固定化过程中对于固定化量与酶活回收的影响。结果显示，较高的异氰酸酯浓度会有效提高单位时间内酶的固定化效率，但同时也会造成酶活损失。固定化前后红外蛋白二级结构分析展现了在异氰酸酯影响下固定化前后酶二级结构的变化。具体而言，α-螺旋比例降低，β-折叠比例升高，这表明酶分子经历了向闭合状态的构象转变，这在一定程度上抑制了酶活性。▲Scheme 2. Chemoenzymatic DKR of primary amines
通过手性胺的消旋化反应验证了催化剂的消旋化性能。结果显示，Pd@CC3可以在低温（50 oC）且未加入碱性添加物的条件下以极高的选择性实现完全消旋化，这得益于催化剂在加热条件下的均相化提高了催化能力，且CC3上富含的亚氨基也为催化消旋化反应提供了碱性微环境，抑制了副反应的发生。在此之后验证了Pd@CC3@CALB对动态动力学拆分反应的催化能力，该催化剂显示了优秀的催化活性与选择性，而且，反应结束后催化剂可以沉淀回收，具有良好的重复使用性。最后，验证了催化剂的底物普适性，结果显示催化剂对含有不同取代基的手性胺均能取得很好的结果。（二）水相一锅法金属-酶级联催化不对称合成手性叔α-芳基环酮本文被选为2021 Green Chemistry Hot Articles。▲Scheme 1. Chemoenzymatic synthesis of chiral tertiary α-substituted cycloketones
本文开发了两步一锅金属-酶级联催化体系，以简单易获得的2-碘环烯酮为原料在离子液体和缓冲溶液组成的双相体系中直接合成一系列手性叔α-芳基环酮（Scheme 1）。该过程中芳基通过Pd催化的Suzuki-Miyaura交叉偶联反应引入到羰基α位，随后通过老黄酶（YqjM）催化的不对称氢化反应构筑含有酸性α-H的手性中心，首次揭示了YqjM催化α-芳基烯酮不对称氢化的能力。通过分子对接技术阐释了酶催化2-苯基环己烯酮和2-甲基环己烯酮两种底物表现出面选择性相反的现象。对活性口袋周围氨基酸进行突变，获得了立体选择性互补的酶突变体，成功合成了(S)-2-苯基环己酮。Table 1 Optimization studies of OYEs-catalyzed AH of 2-phenylcyclohexenoneaa Reactions were carried out at 30 oC in Tris-HCl buffer (pH 7.5) using 1a (5 mM), OYEs whole-cell lyophilizates (0.2 g), NADPH as hydrogen source. b the yields and the values of ee were determined by HPLC. c Using 1a (2 mM). d Using 1a (1 mM). e NADH as hydrogen source. f Using 1a (25 mM). n.d. = not determined.选取三种底物谱较为广泛的老黄酶（OYE1、TsOYE和YqjM）用于催化2-苯基环己烯酮（1a）的不对称加氢反应。实验结果显示只有YqjM能将1a转化为(R)-2-苯基-环己酮（2a），但产率极低，仅为9%（表1 Entries 1-3）。实验过程中发现溶剂对老黄酶的催化活性影响很大，水溶性的乙二醇二甲醚和丙酮严重抑制了老黄酶的催化能力，二甲基亚砜和四氢呋喃虽然能够在一定程度上提升酶催化的产率，但是ee值明显降低（Entries 6-9）。而老黄酶在非水溶性的有机溶剂正己烷、异辛烷和离子液体[BMIm][PF6]中则表现出很好的催化活性，当助溶剂为离子液体[BMIm][NTF2]时，2a的产率可提高到76%，这是由于离子液体（ILs）有着更好的生物相容性和萃取能力（Entries 10-15）。辅酶循环体系的引入更有利于底物的转化，且老黄酶更偏好辅酶NADPH。为避免在反应过程中外加GDH，构建了YqjM和GDH共表达全细胞。实验结果显示，以此为催化剂2a的产率和对映选择性得到了进一步提高（89%产率，99% ee）（Entry 19）。在该双相体系下，底物浓度由原来的5 mM提升为25 mM时，对映体选择性仍然为99% ee，产率仅有3%的下降（Entry 20）。▲Scheme 2. (a) Chemoenzymatic asymmetric synthesis of tertiary α-aryl cycloanones and (b) enzymatic asymmetric hydrogenation of α-alkyl enones
为了提高金属催化剂的催化活性，制备了固定化催化剂Pd@MMSN，将其用于Suzuki-Miyaura交叉偶联反应，并对反应进行了优化。在最优条件下Pd@MMSN可将底物几乎当量转化成产物。在分别优化了化学和生物催化反应后，将两步反应在同一体系中进行级联。首先Suzuki-Miyaura交叉偶联反应发生在IL相中；反应结束后，降低温度到室温并调节pH到中性；随后将生物催化剂YqjM-RBS-GDH加入到体系中，在水/IL界面上将中间产物还原，生成的最终产物被萃取到IL相中。实验结果显示利用一锅金属-酶级联反应体系能够以81%的产率和99% ee的对映选择性得到产物(R)-2-苯基环己酮，无需分离中间产物。成功建立两步一锅法金属-酶法不对称合成(R)-2-苯基环酮的条件后，对反应的底物普适性进行了考察（Scheme 2a）。实验结果显示吸电子基团和供电子基团对反应的影响不大，均得到了不错的结果。取代基位置对反应影响较大，邻位取代的底物由于位阻增大，导致相应产物的产率有所下降。还考察了五元环和七元环的底物，五元环底物能够被成功转化，但由于老黄酶活性口袋仅能催化小分子化合物，七元环底物未能被转化。此外，对于烷基取代的底物也进行了考察（Scheme 2b）。与文献报道的数据相比，利用该双相体系的酶催化反应的产率和对映选择性均得到了提高，更重要的是底物浓度可提升至25 mM，提升了5倍。▲Figure 1. Docking of (a) 2-methylcyclohexenone and (c) 2-phenylcyclohexenone within the active site of YqjM; (e) 2-phenylcyclohexenone within the active site of YqjM mutant; surface representation of the active site view of YqjM with (b) 2-phenylcyclohexenone and (d) 2-methylcyclohexenone; surface representation of the active site view of YqjM mutant with (f) 2-phenylcyclohexenone docked at active site.
在考察YqjM底物谱时发现，对于2-苯基环己烯酮和2-甲基环己烯酮两种底物，YqjM在催化过程中表现出相反的面选择性。利用分子对接技术对两者在YqjM活性口袋中的结合方式进行了模拟实验。Ala-60和Ile-69在YqjM活性口袋的右侧形成了一个深而小的空腔，恰好可以容纳2-甲基环己烯酮α-位的甲基，而不能容纳位阻较大的苯基（Figure 1a-d）。因此2-苯基环己烯酮只能翻转180o使苯基朝向左侧，导致YqjM对于这两种底物表现出不同的面选择性。
未完待续
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