▲共同第一作者：肖海滨，张雯; 通讯作者：李平，唐波；

论文DOI: 10.1002/anie.201906793

前言

今天非常荣幸能够邀请到山东师范大学唐波教授课题组来对他们最新的 Angew. Chem. Int. Ed.文章（DOI: 10.1002/anie.201906793）进行分享，本推文由通讯作者唐波教授和李平教授指导，论文的第一作者肖海滨与张雯博士倾心打造，在此特别感谢唐波教授、李平教授和两位博士的大力支持与无私的分享！唐波教授、李平教授课题组还有很多非常精彩的工作.

研究背景

A. 活性氧物种（ROS）与超氧阴离子自由基（O₂^.-）

多年以来，为了深入揭示活性氧物种（ROS）的生物学作用，我们课题组一直致力于 ROS 的荧光成像研究。ROS 是一类由氧气衍生出的一系列氧化性物种，包括超氧阴离子自由基（O₂^.-），过氧化氢（H₂O₂），羟基自由基（^.OH），单线态氧（¹O₂），次氯酸（HClO），过氧化亚硝酰自由基（ONOO^-）等。在生物体内，ROS 水平被严格控制，并与细胞稳态平衡密切关联。持续产生的过量 ROS 能够导致脂质过氧化、蛋白降解、DNA 破裂，最终导致细胞和机体功能紊乱引起多种疾病，如神经退行性疾病、动脉粥样硬化、糖尿病等。然而，生理浓度水平的 ROS 具有积极有益的调控作用。因此，ROS 被认为是一把“双刃剑”，受到了研究者们的广泛关注。

作为氧气分子的单电子还原产物，超氧阴离子自由基（O₂^.-）是最先产生的 ROS。O₂^.-已经被公认为是重要的氧化还原信号分子，能够调控细胞信号转导网络以及参与细胞命运决定。例如，2008 年程和平课题组采用新颖的线粒体定位的 O₂^.- 探针 cp-YFP，观察到单个线粒体内 O₂^.- 自发性爆发现象，称之为线粒体“超氧炫”。细胞内超氧炫在时间和空间上随机发生，与线粒体呼吸、ATP 合成、钙信号、基础活性氧水平等紧密相关。可以说，超氧炫是反映线粒体功能状态的“数字钟”。

此外，该课题组还发现野生型线虫咽部肌肉细胞的超氧炫频率在第 2-3 天和第 8.5-9.5 天出现两个峰值，恰好分别对应线虫的生育高峰期和开始有个体死亡的阶段。对于长寿或者短寿的突变体线虫，这两个峰的位置和强度都有特征性变化，暗示了线粒体的功能活性与衰老有着密切关系。毫无疑问，O₂^.- 已经成为明星分子，与许多生理和病理学过程紧密相关，因此，发展新的方法实现 O₂^.- 浓度水平的精准检测，已经成为至关重要的研究方向。

B. 荧光成像与荧光探针

荧光成像技术是近年来新型发展的检测技术，具有时空分辨率高、生物相容性好、灵敏度高等显著优势，成为实时检测细胞及活体内生物活性分子的有力工具。该技术的应用离不开性能优良的荧光探针，探针与待测物反应前后，荧光信号的变化可以指示待测物的浓度波动。目前已有的荧光探针包括蛋白荧光探针、纳米荧光探针和有机分子荧光探针，近年来研究者们成功发展了一系列定性或者定量检测 O₂^.- 的荧光探针。利用这些探针，实现了在细胞、组织、活体内 O₂^.- 的荧光成像分析，建立了高灵敏度、高选择性、实时成像 O₂^.- 的新方法，有力地推动了人们对 O₂^.- 生物学作用的深入了解。

研究的出发点

我们课题组从事 ROS 的荧光成像研究已经有十余年，尤其是对于 O₂^.- 的生物探究，我们从未停止。近年来，我们利用 O₂^.- 的本质特性，结合其反应活性和特点，相继突破了细胞内 O₂^.- 的超高灵敏度、动态可逆、准确靶向等检测。为了更好地总结工作、积累经验，进一步推动 O₂^.- 的生物学研究，我们决定对近年来用于活细胞及活体内可视化 O₂^.- 的荧光探针进行综述整理，为 O₂^.- 荧光探针的发展提供理论指导依据。

论文研究的主要内容

O₂^.- 具有浓度水平极低、活性较高、寿命短、易转化等特点。基于我们以及其他课题组大量的工作基础，在这篇综述中，我们详细总结了用于活细胞及活体内检测 O₂^.- 的荧光探针的设计原理、探针构成及应用等，提出了未来构建 O₂^.- 荧光探针的潜在挑战和考虑因素。总的来说，这是一篇非常完善的关于 O₂^.- 荧光探针的综述性文章，为将来构建新型 O₂^.- 荧光探针提出了许多启发性的思路。

图文解析

O₂^.- 荧光探针的研究进展

目前，设计检测 O₂^.- 的荧光探针应考虑的主要因素有特异、可逆、实时检测，超高灵敏度检测，亚细胞区域性检测，与其他活性物种的同时检测等。下面，我们简单介绍本论文综述的检测 O₂^.- 的荧光探针的设计思路。

A. 苯并噻唑啉与 O₂^.- 的抽氢反应

苯并噻唑啉中含有的碳氮单键结构与 O₂^.- 反应后，发生抽氢反应，变为双键结构，从而使荧光探针的信号发生改变（图1）。利用该结构单元，我们最早设计合成了多种特异性检测 O₂^.- 的单光子及双光子荧光探针。

▲图1. 苯并噻唑啉结构及其与 O₂^.- 的反应机理。

B. 利用酚醌互变实现 O₂^.- 的动态可逆检测

生物体系中的 ROS 与还原性系统时刻处于动态可逆平衡，为了在活细胞及活体中实现 O₂^.- 的实时、连续性检测，瞬时响应且动态、可逆的荧光探针是必不可少的。基于邻苯二酚与邻苯二醌的酚-醌互变体系（图2），我们创造性地合成了一系列 O₂^.- 的荧光探针，用于检测氧化还原系统中的 O₂^.- 与谷胱甘肽（GSH）/抗坏血酸（VC）。

▲图2. 邻苯二酚结构及其与 O₂^.- 的反应机理。

C. 高灵敏度检测 O₂^.-

利用化学发光无激发光源，极大地降低了背景荧光干扰的特点，结合化学发光共振能量转移和聚合物的信号放大作用，我们成功构建了超高灵敏度的检测 O₂^.- 的荧光探针，其检测限低至 19.3 pM，利用该荧光探针，我们实现了活细胞及活体水平本真 O₂^.- 浓度水平的检测（图3）。

▲图3. 化学发光纳米 O₂^.- 探针的构建及其检测机理。

此外，利用含碲碳点的聚集信号放大作用，我们合成了检测 O₂^.- 的碳点，实现了 O₂^.- 的超高灵敏度检测，其检测下限低至 8.0 pM。该探针被成功用于区分正常细胞和肿瘤细胞内本真的 O₂^.- 浓度水平，并被用于在不同刺激模型下（如运动、噪音干扰、抑郁），活体水平 O₂^.- 的浓度差异（图4）。

▲图4. （A）含碲纳米碳点的制备及其与 O<sub style="text-indent: 28px;caret-color: red;color: rgb(89, 89, 89);font-family: "Helvetica Neue", Helvetica, "Hiragino Sans GB", "App