推荐一篇发表在Nature Chemical Biology上的论文,题目为“A natural small molecule alleviates liver fibrosis by targeting apolipoprotein L2”,通讯作者是中山大学附属第一医院的精准医院研究院的郭剑平教授和中山大学药学院的尹胜教授。郭剑平教授课题组的研究方向是肿瘤微环境与肿瘤发生、发展相关信号转导通路。尹胜教授课题组的研究方向主要涉及天然药物化学、天然有机化学。
肝纤维化是各种慢性肝损伤疾病累积的结果,持续的肝纤维化可能导致肝功能受损、肝硬化,并最终发展为肝癌,然而目前尚无有效的治疗方案。天然产物具有复杂的结构和生物活性,是药物发现中的宝贵来源。在本研究中,为了从天然产物中发现新型的抗肝纤维化先导化合物,作者构建了一个结构多样的毒参科植物二萜类化合物库,并利用高内涵高通量筛选平台评估其抗肝纤维化的潜力。纤维连接蛋白(FN)作为肝纤维化的关键生物标志物,主要由TGF-β1诱导激活的肝星状细胞(HSCs)合成。为筛选有效的抗肝纤维化化合物,研究人员通过免疫荧光技术监测TGF-β1刺激下的LX-2细胞中的FN表达,进而筛选了由195种天然产物构成的二萜类化合物库。结果显示,DP作为一种有效的抗纤维化先导化合物被成功筛选出来,该化合物在多种肝星状细胞系及小鼠模型中表现出显著的抗纤维化效果。为了确认DP的抗纤维化靶点,作者合成了DP的光交联探针(DP-PT),首先验证了DP-PT在LX-2细胞中仍保留良好的抗肝纤维化活性。接下来在LX-2活细胞和LX-2细胞裂解液中进行标记实验,并同时设置DP竞争组,通过化学蛋白质组学的流程对富集的蛋白进行了质谱鉴定。作者设置了相应的cutoff来筛选靶点,发现APOL2是唯一的候选蛋白。为了进一步确认,作者在细胞水平和蛋白水平上进行了探针的IP实验,发现内源性APOL2可以在剂量依赖性条件下被探针Pulldown,并可以被DP阻断,证明了APOL2是DP直接作用靶点。为了进一步确认DP在APOL2上的特定结合位点,首先对APOL2进行了截短,发现DP-PT主要结合到APOL2的M结构域,该区域位于内质网(ER)内。此外,作者通过质谱确认光交联位点为M结构域中的两个氨基酸残基(T203和Y239)。基于光交联位点以及分子对接,作者预测了七个空间相邻的氨基酸残基——G200、N212、V199、V216、I227、L209和I246作为DP-APOL2的潜在结合位点。并通过突变,确认其中N212和V216是关键的结合残基。确定了APOL2是DP直接作用靶点以及结合模式之后,作者开始探索APOL2在肝纤维化中的潜在作用。首先繁殖出全身Apol2敲除的小鼠,发现与野生型小鼠相比,Apol2敲除的小鼠对四氯化碳诱导的肝损伤和纤维化表现出显著的抗性。为了研究具体的分子机制,作者首先探索DP处理或APOL2敲降对TGF-β1/Smad2/3信号通路没有影响。因此,作者进行了APOL2的IP实验,发现ER定位的SERCA2是其相互作用蛋白。值得注意的是,TGF-β1刺激增强了APOL2和SERCA2之间的相互作用,这种相互作用可以被DP破坏。
SERCA2功能是调节内质网(ER)Ca2+稳态,减轻PERK依赖的内质网应激。首先作者通过实验证明TGF-β1内质网应激, 增加细胞质Ca2+水平,而DP处理或APOL2敲降会平衡TGF-β1诱导的胞质Ca2+水平的增加,从而恢复SERCA2调节ER Ca2+的功能;同时DP处理或APOL2敲降也会抑制内质网应激相关PERK途径中的p-PERK、ATF4及HES1的表达。总之,DP通过调节APOL2-SERCA2相互作用,影响ER应激介导的PERK-HES1轴来发挥其抗纤维化作用。
总而言之,本文通过高内涵的筛选平台获得了一种有效的抗肝纤维化的天然分子,并利用化学蛋白质组学以及多种分子生物学手段确定抗纤维化的机制。
本文作者:ZJ
责任编辑:FTY
文章链接:
https://www.nature.com/articles/s41589-024-01704-3
原文引用:DOI:10.1038/s41589-024-01704-3
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