分享一篇发表在ACS Appl. Mater. Interfaces 上的文章，文章的题目是“ Remodeling of Cellular Surfaces via Fast Disulfide–Thiol Exchange To Regulate Cell Behaviors ”，文章的通讯作者是同济大学的 李永勇 教授。
细胞膜不仅 被认为是将细胞与外部环境分开的边界，而且还是决定细胞命运和行为的场所。细胞表面工程 (CSE) 通常可以通过共价或非共价地在细胞膜上构建有机或无机材料来实现，用于多种目的，包括有针对性的交付，细胞保护，逃避免疫系统识别的细胞掩码，细胞迁移控制，和细胞受体的调节等等。
CSE 作为一种有前途的策略，为基础生物医学研究和临床环境的细胞表面重塑开辟了一条新途径。然而，目前实现 CSE 的方法存在巨大挑战。特别是基于静电相互作用的工程方法可能会对阳离子物质的毒性产生重大影响。同时，基于共价化学的方法可能会因为不可切割的连接而对细胞功能造成不利影响。 因此，成功的表面建模过程需要经过特殊设计的表面快速用于预期目的，而且可以生物擦除以避免对细胞活性产生永久影响。
在这项研究中，开发了一种动态 CSE 方法，通过快速和可逆的二硫化物 - 硫醇交换将牛血清白蛋白 (BSA) 组装到细胞表面。合成了含有还原 BSA 的多个硫醇基团 (rBSA) 和硫醇激活的 rBSA (tBSA) 。 5-Thio-2-nitrobenzoate (TNB) ，作为一种有效的离去基团，被用来介导 tBSA 和细胞表面或 rBSA 上所含的硫醇之间的快速二硫化物 - 硫醇交换。随后，通过将细胞与 tBSA 和 rBSA 交替孵育，通过二硫键连接的网络固定，进行逐层组装过程（ 方案 1 ）。这种方法快速、细胞相容且可能具有普遍性。在这项研究中，利用基于蛋白质的 CSE 从细胞表面发起的时间应力来操纵细胞行为。
方案 1. 通过快速、细胞相容性二硫化物-硫醇交换在细胞表面重塑中生长二硫化物固定白蛋白壳的顺序组装过程示意图
TNB 介导的快速硫醇-二硫化物交换
TNB 是一种有效的离去基团，用于激活蛋白质的游离硫醇，以便在温和条件下快速形成二硫化物。发现 TNB 中硝基苯基团的高吸电子能力增强了 tBSA 与 rBSA 的二硫化物-硫醇交换（图1a）。在 TNB 的协助下，tBSA (0.25 mg mL –1 ) 在 3 min内与 rBSA (0.25 mg mL –1 )快速彻底地反应，如分离显色产物 TNB 的特征紫外吸光度 (412 nm) 所示(图1b)。作为对照，二硫化物吡啶用于激活 BSA 的硫醇。二硫化物吡啶活化表现出更慢的过程，甚至在 12 小时内都没有完成（图1b）。非变性 PAGE 测定进一步证明了不明显的游离 BSA 条带，表明与 rBSA 和 BSA 相比，tBSA 和 rBSA 之间反应彻底（图1c）。
图 1. TNB 介导的快速硫醇-二硫化物交换。(a) rBSA 与 tBSA 或 BSA 蛋白质分子的二硫键交换示意图；(b) DTNB 激活的 rBSA (tBSA) 与 PBS 缓冲液中的 rBSA 和 dBSA 作为对照的二硫化物交换动力学。TNB（rBSA + tBSA；412 nm）和α-巯基吡啶（rBSA + dBSA；340 nm）的吸光度被用作反应的指示剂；(c) 原生 PAGE 测定，证明 tBSA 与 rBSA 与 rBSA 和 BSA 蛋白分子分别在 12 小时和 24 小时发生完全反应，在此期间未观察到游离 BSA 的迁移带。 本研究中使用的 B16 细胞和 DC2.4 细胞的特征是每百万细胞具有 20.52、10.89 nM 表面硫醇 （图 2a ）。细 胞表面的游离硫醇通过二硫键-硫醇交换为表面工程过程奠定了基础，这会影响蛋白质组装到细胞表面的有效性。 –1 时的 LSCM 图像；(c) 在 0.05、0.1 和 0.25 mg·mL –1 下重塑 B16 细胞的荧光强度，通过流式细胞仪检查；(d) 以天然 B16 细胞作为对照进行表面重塑后 B16 细胞的细胞活力，以及 (e) 表面重塑细胞和通过台盼蓝孵育淬灭的细胞的荧光图像，由 LSCM 可视化。 稳定的 BSA 层通过双重组装过程在 B16 和 DC2.4 细胞表面形成，整个细胞周围的尖锐荧光证明了这一点，而对于所有三种组装浓度，细胞内部几乎没有观察到 任何可见荧光（图2b）。流式细胞术分析B16细胞荧光强度（ 图 2c ). Cell counting kit-8 (CCK8) 检测证明有活力的重塑细胞，在较高浓度 (0.25 mg mL –1 ) 下活力略有下降（ 图 2d ）。一种已知的异硫氰酸荧光素 (FITC) 荧光猝灭剂，它几乎完全减弱了细胞周围 FITC 的绿色荧光，而在没有淬灭及的情况下它看起来相当明显，如激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM) 所示（图 2e ) 。这些是表面工程过程发生的明确证据。
重塑表面的动态特性
为了评估解释二硫键可逆性的蛋白质层的动态行为，将重塑细胞（在0.25 mg mL –1下获得）暴露于GSH，可裂解二硫键（图3 a） . 通过SDS-PAGE 分析表征在细胞上清液中发现了分离的BSA 蛋白；然而，未观察到作为对照的条带（图3b）。添加GSH后还检测了分离BSA荧光强度的定量数据（ 图 3 c)，结果表明GSH处理通过加速其脱离明显提高了上清液的荧光强度。为了进一步说明蛋白质壳在生理条件下是否可生物吸收，使用LSCM（0.1 mg mL –1 的细胞工程）在标准培养条件下观察板中表面重塑的B16 细胞的长期培养动态荧光变化。在 24 小时孵育期间，可以看到细胞表面的荧光（绿色）逐渐消退，表明表面工程材料的吸光度或脱离（ 图 3 d)。此外，通过快速二硫化物-硫醇交换重塑细胞表面的能力突出了调节细胞行为和活性的可行性。
表面工程细胞的形态学和增殖
通过扫描电子显微镜 (SEM) 和透射电子显微镜 (TEM) 固定和观察天然细胞和重塑细胞的形态。 与天然细胞的粗糙表面相比，重塑的 B16 细胞表面似乎更光滑（ 图 4 a、b）。同样，TEM 图像显示表面重塑后的圆形细胞形态，细胞表面伪足减少（ 图 4 c、d）。与天然细胞对应物相比，模糊的膜结构归因于蛋白质的掺入（ 图 4 e,f, 放大图像）。结果证实，表面工程细胞保持了细胞形状并具有更光滑的表面 。
图 4. 表面工程细胞的形态学和增殖特征。 SEM 图像：(a) 天然 B16 细胞； (b) 改造的 B16 细胞； (c,d) 天然和改造 B16 细胞的 TEM 图像； (e,f) 原生和表面重塑 B16 细胞的放大 TEM 图像（箭头表示壳的差异，比例尺：100 μm）； (g) 培养 72 小时后表面重塑细胞的形态变化。 天然 B16 细胞用作对照。 通过光学显微镜观察培养72 h后表面工程化细胞的动态形态变化。 发现天然 B16 细胞在 3 小时内迅速粘附在 24 孔板上，并呈现出类似于上皮细胞的形状。 相比之 下，重塑的细胞（组装过程中的材料浓度为0.05 mg·mL –1 ）需要一天时间才能粘附，并且看起来更像淋巴母细胞，开始时呈球形。材料浓度为 0.25 mg mL –1的表面重塑细胞显示出球形形态，粘附时间更长（图 4 g）。
调节细胞行为
长期细胞增殖应该在与表面工程相关的机械应力下受到调节。 为了评估应激对增殖的影响，CFSE（一种长寿命染料）在表面工程处理之前被用于共价标记 B16 细胞，作为固有的增殖指示剂。 表面工程化 B16 细胞的荧光强度呈时间和浓度依赖性。 在 72 小时 监测期间（0、8、16、24、48 和 72 h），仅观察到表面工程细胞的 CFSE 荧光强度缓慢降低，这与 B16 细胞的荧光强度迅速降低形成鲜明对比。在那些具有不同材料浓度的表面工程 B16 细胞中，在 0.25 mg·mL –1的相对高浓度下重塑的细胞在 72 小时时仍显示出相当大的荧光强度（ 图 5 A）。这些结果表明，在表面重塑的蛋白质壳阻止了改造的 B16 细胞快速分裂并使它们处于延迟状态。
图 5. 调节细胞行为。 (a) 72 小时期间的 CFSE 检测表明，与天然细胞相比 ，不同蛋白质浓度（0.05、0.1 和 0.25 mg·mL –1 ）改造的 B16 细胞增殖迟缓； (b,c) 流式细胞术显示在不同表面重塑条件下难渗透大分子（FITC-葡聚糖，绿色）的细胞摄取效率，定量数据总结在（c）中； (d) LSCM 图像证实 FITC-葡聚糖渗透到表面重塑细胞的细胞质中，并且 (e) 另一种难以渗透的染料 PI（红色）进入表面重塑细胞（0.1、0.25 mg·mL –1 )，而如果不是立即孵育 PI，而是在表面工程化过程（钙黄绿素，绿色）后 24 小时孵育 PI，则观察到较少的吸收。 0.25 mg mL –1 组的绿色荧光减少 表明在高浓度下细胞活力部分丧失。
FITC-葡聚糖 ( MW 3000-5000 ) 是一种以最小细胞渗透性着称的大分子，被用作细胞内递送分析的模型。 表面重塑后，与表面重塑的 B16 细胞共孵育时，发现 B16 细 胞中有大量 FITC-葡聚糖的细胞内积累。通过流式细胞术进行的定量测量显示，与天然细胞相比，表面工程在 0.25 mg mL –1时实现了约 8 倍的摄取效率 （ 图 5 b、c）LSCM 明显增强了摄取，其中 B16 细胞表面以 0.25 mg mL –1进行工程改造，在细胞质内明显表现出更强的荧光（ 图 5 d) 。应该注意的是，这种摄取行为的改善是暂时的，因为如果在 24 小时后与重塑细胞共同相互作用，PI 内在化要低得多（即 PI 不是立即孵育，而是在表面工程化过程后 24 小时孵育）（ 图 5e ）。上述结果表明细胞渗透性可以通过动态表面工程过程方便地调节和恢复。
总之，开发了 TNB 介导的快速 可逆二硫化物-硫醇交换，以通过逐层组装动态重塑细胞表面。这种方法能够通过细胞相容且方便的途径在细胞表面设计可控的白蛋白蛋白壳，并在 30 分 钟内快速完成。 该方法可能对其他细胞具有普遍性，因为它们中的大多数都富含硫醇
原文链接：https://doi.org/10.1021/acsami.9b17550
图 2. 细胞表面重塑的特征。(a) B16 细胞和 DC2.4 细胞的蛋白硫醇水平；(b) 重构的 B16 和 DC2.4 细胞分别在 0.05、0.1 和 0.25 mg·mL –1时的 LSCM 图像；(c) 在 0.05、0.1 和 0.25 mg·mL –1下重塑 B16 细胞的荧光强度，通过流式细胞仪检查；(d) 以天然 B16 细胞作为对照进行表面重塑后 B16 细胞的细胞活力，以及 (e) 表面重塑细胞和通过台盼蓝孵育淬灭的细胞的荧光图像，由 LSCM 可视化。
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