给大家分享一篇发表在J. Am. Chem. Soc.的文章，用于共价配体定向化学释放的可调甲基丙烯酰胺（DOI: 10.1021/jacs.0c10644）。本文的通讯作者Nir London, 是魏茨曼科学研究所有机化学系高级科学家(助理教授)。研究方向：开发计算和经验筛选技术，促使与目标蛋白形成共价键的共价化合物的发现成为可能；设计软件，以评估形成共价键的新化合物的精确结构适合性；开发快速识别共价结合化合物的实验技术平台，并成功应用于多种目标。

靶向共价抑制剂是一类重要的药物和化学探针。然而，相对较少的亲电试剂满足成功共价抑制剂设计的标准。丙烯酰胺已被广泛用作许多含有非催化半胱氨酸的蛋白质的不可逆共价抑制剂的亲电试剂。这种不可逆抑制剂具有非平衡动力学、完全目标占据和灵活改变ADME (吸收、分布、代谢和排泄)结构而不影响效力和选择性的优点。共价抑制剂的效率取决于与蛋白质的初始可逆结合以及随后与目标亲核试剂形成共价键的速率。前者取决于其可逆结合动力学，而后者取决于亲电试剂的反应性及其精确定位。丙烯酰胺的固有反应活性受到其胺前体性质的强烈影响，在不影响配体可逆结合的情况下，胺前体的改性是复杂的。此外，α-或β-位的取代通常会降低丙烯酰胺的反应性。另一方面，α位的吸电子基团增加了丙烯酰胺的反应性，同时赋予共价键形成的可逆性。丙烯酰胺反应活性的可调性对于设计靶向共价抑制剂很重要。最近，丙烯酰胺类似物如丙烯酰胺、炔丙基酰胺、炔基苯并噁嗪和二氢喹唑啉被报道为共价反应基团。然而，它们在结构和几何形状上与丙烯酰胺有显著的不同，因此反应性部分不能简单地转换而不需要可逆结合支架的修饰。文章描述了一种能够调节亲电反应性，同时保持与原始丙烯酰胺相似的几何形状，并且还可以用于将靶向共价抑制剂修饰成荧光、化学发光或其他功能化的探针的方法。

在靶向共价抑制剂的背景下，探索了α-取代的甲基丙烯酰胺作为具有不同反应活性的亲电弹头。这些化合物与亲核试剂形成共价键，随后伴随释放β-位的离去基团。在蛋白质中赖氨酸和半胱氨酸的生物结合中也有类似的化学报道，但在靶向抑制剂中没有报道。文章表明它可以用来调节选择性共价抑制剂的反应活性。此外，利用离去基团的释放来功能化共价抑制剂，并将其转化为共价配体定向释放(CoLDR)探针。用针对BTK、EGFR和K-Ras^G12C的启动荧光探针和针对BTK的启动化学发光冷反应探针证明了这一概念。高通量筛选，验证其作为传统激酶体外测定的替代物的用途。

首先，作者合成了一组12种不同α-取代的N-苄基甲基丙烯酰胺的亲电试剂与作为模型硫醇的还原型谷胱甘肽(GSH)反应，并通过液相色谱/质谱监测反应随时间的变化。所有丙烯酰胺的活性都明显低于IA-alkyne。

研究α-取代基的反应活性和离去能力

α-甲基丙烯酰胺显示出不同的蛋白质组反应性

为了在不可逆共价抑制剂的背景下评估这种化学反应，选ibrutinib(布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)的一种不可逆抑制剂)作为模型化合物。所有这些化合物都显示出重组BTK激酶结构域的共价结合，通过完整蛋白液相色谱/质谱进行评估。并对所有抗BTK的ibrutinib衍生物进行了体外激酶活性测定和基于谷胱甘肽的反应性测定。尽管在体外激酶活性测定和与BTK的液相色谱/质谱反应活性测定中更有效，但这些化合物显示出比ibrutinib对谷胱甘肽更低的反应活性。这些化合物与谷胱甘肽的低反应活性可能是由于迈克尔受体周围空间位阻的增加，这也可能将丙烯酰胺锁定在固定的构象中。丙烯酰胺的固定几何形状也有助于这些化合物与BTK有效反应。通过实验证明具有取代的甲基丙烯酰胺的所有四种抑制剂(3c，3e，3h和3i)显示出与ibrutinib相似的活性，表明细胞参与以及对细胞条件的稳定性。通过竞争性的isoTOP-ABPP证明ibrutinib衍生物的选择性。与3c和3h相比，ibrutinib标记的重要靶的数量略高。BTK是所有三种抑制剂最重要的目标。为了获得比ibrutinib更定量的化合物选择性评估，选择了ibrutinib的五个主要激酶非靶标，并测量了ibrutinib与3c、3h、3e和3i的体外IC₅₀。与ibrutinib相比，合成的化合物对所有酶的选择性都有所提高，3h和3i的选择性特别高，对ERBB2和ITK的选择性几乎高2个数量级。

潜在抑制剂的ibrutinib取代衍生物

接下来用BTK处理探针3k，测量释放的香豆素荧光，并通过液相色谱/质谱验证标记。用BTK重复了实验，验证荧光的增加是由于香豆素结合BTK后的释放，该实验预先与ibrutinib的非共价类似物进行了孵育，发现荧光的增加是与BTK相互作用的结果。同样用探针4b和5a进行了验证。这些探针显示出高灵敏度和信号背景比。因此，设计并合成了一种由ibrutinib衍生的化学发光探针(3l)，用于BTK活化。通过实验证明探针可以用来测量BTK结合。为了证明这些化合物的可能用途，对3725种生物活性物质进行了高通量筛选化合物。其中，488种化合物(13%)显示出一定的BTK抑制作用，其中216种(6%)抑制了至少70%的信号；216种强效化合物中有121种是已知的激酶抑制剂，12种已知的BTK抑制剂中有11种是已知的激酶抑制剂库被确定为强作用。又选择了25个完全抑制BTK并且未被报道为BTK抑制剂的命中，通过剂量反应进行验证。对9种显示出与ibrutinib相当的抑制作用的化合物进行了1小时的BTK细胞抑制作用的进一步测试。4种化合物，均为激酶抑制剂，在细胞剂量反应中进一步测试，显示出对BTK磷酸化的细胞抑制作用。

CoLDR化学打开荧光探针

总之，文章提出了一类新的取代甲基丙烯酰胺，将大大扩展靶向共价抑制剂的范围，并允许它们在各种应用中的功能化。