今天跟大家分享的是今年发表在Chemical Science上的一篇文章，文章的题目是Fastprotein analysis enabled by high-temperature hydrolysis （DOI：10.1039/d0sc03237a）。本文的通讯作者是清华大学的欧阳证教授，他主要研究质谱仪分析器基本原理，采样离子化方法，数据分析；研制气态离子化学科学研究仪器，离子阱质谱仪小型化，发展生物医学分析方法。

质谱已成为鉴定蛋白质一级序列、翻译后修饰(PTMs)和蛋白质相互作用的有力工具。尽管蛋白质组学研究和蛋白质生物标记物识别在临床诊断或治疗中的潜力已经投入了巨大的努力，但目前基于质谱的蛋白质分析程序仍然耗时费力，与潜在的临床或即时检验(POC)应用不兼容。自下而上蛋白质组学是蛋白质分析中应用最广泛的方法之一，它通常要求蛋白质通过具有高测序选择性的蛋白酶消化成肽。然而，大多数基于蛋白酶的消化方法也需要长时间的培养。而且在酶解过程以及随后的富集过程，通常需要蛋白质溶液中高浓度的盐，这与液相色谱-质谱分析也不兼容。尽管已经做出了一些工作加速酶消化过程，但ESI-MS分析仍会因耗时的纯化和消化后样品处理程序而减慢。因此建立一种快速、简便的蛋白质分析方法，这不仅对蛋白质组学研究有重要意义，而且对蛋白质分析在临床诊断中的应用也有重要意义。

基于此，本文开发了一种用于蛋白质快速选择性水解的无酶微反应系统(图1)，该装置在高温条件下培养使蛋白质水解，并使用弱有机酸，能够在蛋白质或肽中的天冬氨酰残基(Asp)处实现选择性裂解，还可以在蛋白质溶液中加入还原剂，二硫键也可以在快速水解的同时被剪切，从而可以分析蛋白分子。之后作者通过水解泛素（76个氨基酸，5个天冬氨酸位点，分子量为8.56kDa）来评价该微反应体系的有效性和效率，并用泛素考察了温度、加热时间和溶剂组成对实验结果的影响(图2)。从图中可以看出水解前泛素离子以正离子模式呈现+7、+8、+9、+10、+11 的多电荷态（图2a）。水解后，在m/z 650-1250范围内观察到大量肽峰（图2b），表明泛素在高温反应中已被分解。这些肽段归因于肽链在X-Asp和Asp-X位点的裂解。正如预期的那样，五个Asp（天冬氨酸）位点均被切割（图2c）。从图2d、2e、2f中可以看出水解的最优条件为：甲酸浓度为2%（v/v），温度为130~180℃，加热时间为2-5 min。

  之后作者用该装置研究了大蛋白-牛血清白蛋白(BSA，分子量: 67kDa)（图3）。从图中可以看出蛋白质中二硫键断裂，通过还原和水解两种分离工艺的结合，牛血清白蛋白的肽段可以被完全裂解，说明将高温微反应体系应用于复杂蛋白质的分析是可能的。之后又利用糖蛋白和磷酸肽研究了酸性、高温、高压溶剂条件对蛋白质水解过程中糖基和磷酸盐稳定性的影响。尽管在高温水解过程中，糖基化和磷酸化翻译后修饰被裂解，但还是可以从得到的其它肽残基看出翻译后修饰。

总之，本文作者开发了一个快速直接分析蛋白质的微反应系统。在微反应器中，蛋白质在高温(~150℃)和弱酸条件下水解，使一系列蛋白质在2分钟内选择性地在天冬氨酰位点分解，水解液不含盐，可直接用于纳米电喷雾质谱分析。通过在溶液中加入还原剂，还实现了肽键和二硫键的一步裂解，从而可以快速分析大分子蛋白质。微反应系统体积小，避免使用高压，只需要简单的蛋白质水解步骤。