分享一篇发表在Nature Communications的研究论文，题为“Quantitative CRACI reveals transcriptome-wide distribution of RNA dihydrouridine at base resolution”，通讯作者为芝加哥大学的何川教授和香港科技大学的张理升老师。他们的研究聚焦于RNA化学修饰的检测与相关的生物学功能。

二氢尿苷是tRNA中最常见的修饰碱基之一，但由于缺乏灵敏、定量的检测手段，其在哺乳动物中的分布特征和生物学功能长期未明。以往检测二氢尿苷的测序方法（如Rho-seq与D-seq）依赖于逆转录终止信号，灵敏度较低且背景噪声较高，无法实现修饰比例的定量评估。为解决这一问题，作者开发了CRACI（Chemical Reduction Assisted Cytosine Incorporation sequencing）技术，通过化学还原结合逆转录错配信号的方式，实现了高灵敏、高精度的二氢尿苷检测。

具体而言，研究者利用KBH₄将二氢尿苷进一步还原，使其在逆转录过程中倾向与G配对，从而产生T-C的错配信号。通过调节dGTP/dNTP比例（1mM/100μM）并使用HIV逆转录酶，CRACI可在RNA序列的256种可能的序列背景下实现高达96%的突变率。利用合成RNA建立的校准曲线证实了该方法在不同背景下的线性定量性能，并在rRNA检测中验证了其极低的假阳性率。

利用CRACI，作者首次在全转录组范围内定量绘制了人源HepG2细胞中二氢尿苷修饰的分布图谱。结果显示，二氢尿苷修饰主要位于tRNA的D-loop区域。在HepG2线粒体tRNA中，CRACI方法检测到了两个新的修饰位点。

作者还将CRACI应用于小鼠胚胎干细胞（mESC）和拟南芥，发现D修饰在三种物种的tRNA中均集中于D-loop区域。作者同样在拟兰芥的叶绿体tRNA及23S rRNA中发现了二氢尿苷修饰位点，提示这一修饰在进化过程中具有显著保守性。

为了进一步明确不同DUS家族酶在二氢尿苷修饰形成中的作用，作者通过siRNA敲低实验定量分析各位点修饰变化，并精确对应其的修饰酶。结果表明，DUS1L负责催化D16/D17修饰，DUS2L催化D20（并在线粒体中催化D16/D17/D20），DUS3L催化D47，DUS4L催化D20a。不同DUS之间存在互补和补偿效应：当一种DUS被敲低时，其靶位点修饰下降，而其他位点修饰可能升高。此外，作者发现D20a与D20之间存在顺式负调控关系：D20a的存在会抑制邻近的D20形成，提示局部RNA结构变化可能影响DUS酶的结合与活性。

最后，研究者将CRACI扩展至人类mRNA的检测。通过使用无修饰的体外转录RNA作为对照，作者在HepG2 mRNA中识别出8个置信度较高的二氢尿苷修饰位点，其修饰比例为10%至40%，首次证明了二氢尿苷修饰可出现在哺乳动物mRNA中。

总体而言，该研究通过开发CRACI技术，实现了RNA二氢尿苷修饰的单碱基分辨定量检测，首次系统绘制了哺乳动物及植物的tRNA D修饰图谱，明确了不同DUS酶的位点特异性与相互调控机制，并揭示了D修饰在进化层面的保守性及在人类mRNA中的稀有存在。

本文作者：HXH

责任编辑：TZS

DOI：10.1038/s41467-025-63918-w

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-63918-w