虽然在自然界中，催化氨基酸γ位置换反应的PLP依赖酶相当普遍，但能够利用碳源作为亲核底物的情况却相对罕见。最近发现的PLP依赖酶 Fub7具备独特的Cγ-C键形成能力，其催化O-乙酰基-L-高丝氨酸（OAH）与烯醇异构化的醛合成烷基取代的Pipecolic acid。然而，尽管这些酶展现出卓越的催化特性，其催化机制仍然难以准确把握，而结构信息的匮乏也限制了对其广泛应用的理解与探索。

近期，加利福尼亚大学圣芭芭拉分校Yang Hai课题组采用X射线晶体学、光谱学、定点突变实验以及分子对接模拟的方法，对Fub7的催化机理进行了详尽的研究，揭示了Fub7催化作用的底物特异性、立体选择性和区域选择性的结构基础。该研究工作不仅为进一步开展蛋白质工程提供了深刻理解，还有望为合成非典型氨基酸提供新的方法。

将Fub7的亲核底物的范围扩展至惰性的酮羰基化合物2（a-d），发现Fub7对非对称酮底物的依赖，表现出在γ位烷基化反应中的区域选择性。

通过捕捉Fub7与OAH以及其类似物L-vinylglycine的单晶复合物和X-ray衍射，明确阐明了Fub7生成s-trans 构象的Vinylglycine ketimine中间体并发现了发现了一个长度约为21 Å的疏水通道（见图a）。该通道的疏水性质以及其较长的长度可能有助于解释Fub7对较长链状疏水底物的倾向。通过分子对接模拟的结果（见图b和c）揭示，亲核底物在反应中仅能从PLP的re-face进行攻击。关键的Y113氨基酸被推测可能在识别和激活酮羰基或醛发挥作用，从而促进酮或醛的异构化。对于非对称酮底物的区域选择性可能是由于底物与酶之间的相互影响，导致R273残基的自由转动受到限制，最终导致动力学烯醇构型更易于参与反应，实现了非对称酮底物的区域选择性。

在催化OAH与α-甲基取代醛的反应中，Fub7表现出良好的立体选择性（d.r. = 9:1）。分子对接模拟的结果（见图c）显示，α-甲基基团位于T388附近的一个狭小的侧袋中。该侧袋的大小仅允许氢原子或甲基的容纳，证实了之前的观察结果，即Fub7对于在Cα位置上具有乙基或更大取代基的醛并不兼容。这一假设得到了定点突变实验的验证，通过将T388突变为丝氨酸的方式，成功扩大了该侧袋。相对于野生型Fub7，这种突变体能够兼容α-乙基取代的醛。

该研究首次提供了 Cγ-C 键形成的PLP依赖性酶的晶体结构，揭示了Fub7催化作用的结构基础，包括确定其底物特异性、区域选择性和立体选择性的结构决定因素。该研究也为未来利用Fub7进行结构导向的蛋白质工程和生物催化合成提供基础。