分享一篇发表在 nature communications上的文章，题目为“Noncanonical amino acids as doubly bio-orthogonal handles for one-pot preparation of protein multiconjugates”。用于位点特异性蛋白质修饰的非规范氨基酸（ncAA）的遗传编码已广泛应用于许多生物学和治疗应用。为了有效地制备均质蛋白质多缀合物，作者等人设计了两种可编码的非规范氨基酸pTAF和mTAF，其含有相互正交和生物正交的叠氮化物和四嗪反应柄。含有TAF的重组蛋白和抗体片段可以容易地在一锅反应中以即插即用的方式用市售荧光团、放射性同位素、PEG和药物的组合官能化，以提供蛋白质双重缀合物，从而在小鼠模型中评估肿瘤诊断、图像引导手术和靶向治疗的组合。此外还证明，同时将mTAF和含酮的ncAA通过两个无义密码子接到一个蛋白质允许制备位点特异性蛋白质三缀合物。TAFs是一种双生物正交手柄，可以有效地、可扩展地制备均一的蛋白质多偶联物。

双功能NCAA PTAF的设计、合成及遗传编码

选择了结构较小的四嗪和叠氮基团。设计了一条简便且可扩展的合成路线来合成pTAF。简而言之是通过BOC-L−4-氰基苯丙氨酸与4-叠氮丁腈在水合肼和3-巯基丙酸存在下反应生成1，2-二氢四嗪，然后氧化和脱保护得到pTAF。

然后将pTAF位点特异性地引入蛋白质中。使用Schrödinger软件，通过固定位于PTAF的叠氮丙基团的一定距离以内以内的Q65、S158和N162残基的突变来实现。通过定向进化，获得了一个MjTyrRS突变体，命名为pTAFRS，它具有Q65S、S158G和N162G突变，并有效地将pTAF整合到含有Y151处琥珀密码子的绿色荧光蛋白(SfGFP)中。在1 mM pTAF的存在和无菌条件下，分别诱导了携带报告基因pET22B-sfGFP-Y151TAG和含有琥珀抑制基因pTAFRS/tRNatyr的pULTRA的大肠杆菌BL21(DE3)细胞。定量荧光分析表明，有pTAF存在时的荧光是没有pTAF时的80倍。用Ni-NTA亲和层析纯化含有PTAF残基的His标记的sfGFP，并用SDS-PAGE分析纯度。

图1 pTAF在蛋白质中的定点结合

蛋白质标记反应相互正交性的验证及反应速率常数的确定

验证含PTAF的蛋白质能够同时、正交、高效地被二苯并环辛炔(DBCO)和TCO标记，结果表明，在氨基酸和残基水平上均没有观察到空间位阻对叠氮化反应活性的明显影响，表明叠氮化和四氮之间的丙基键长度足够长，可以实现高效的一锅双反应。

图2 蛋白质标记反应的相互正交性验证和速率常数的确定

高信噪比肿瘤快速成像抗体片段近红外染料与聚乙二醇偶联物的制备

近红外荧光(NIRF)成像在活体肿瘤的非侵入性成像方面具有巨大的潜力，该技术已被证明是在手术中在荧光引导下实现肿瘤组织彻底切除的实用技术。例如，针对前列腺特异性膜抗原(PSMA)的NIRF成像正在成为一种有吸引力的完全切除前列腺癌组织的手术策略。

为了能够在高信噪比的情况下对前列腺肿瘤进行快速的NIRF成像，我们用pTAF对J591抗体Fab片段进行了修饰，使其能够与DBCO-Cy7和TCO-PEG20K偶联。

为了确定J591Fab-Cy7-PEG20K双偶联物是否具有更好的体内肿瘤成像性能，我们选择了低表达PSMA的22Rv1肿瘤，可以用它来测试两种偶联物的检测下限，并模拟PSMA表达的异质性。

图3 抗PSMA抗体片段近红外染料与聚乙二醇偶联物的制备及最佳时间窗对PSMA阳性肿瘤的显像

双模PET和荧光图像引导手术中抗PSMA抗体片段的双标记

双模式成像既可用于术前肿瘤病变的免疫电子发射断层扫描(PET)成像，也可用于术中在荧光图像引导下识别肿瘤边缘。用放射性核素和荧光探针标记的抗体已被证明具有治疗PCa52的双重药剂的潜力。然而，常规标记和随机标记中使用的探针的结构施加的限制会降低探针的批次重复性和生物活性。为了证明这里描述的平台的实用性，作者等人通过将J591Fab-A121-pTAF与荧光DBCO-Cy5和TCONOTA(NOTA=1，4，7-三氮杂环烷-N，N’，N’’-三乙酸)偶联，再次将PSMA用于PCA的双模式成像。

图4 抗PSMA抗体片段双偶联物的制备及荧光图像引导下小鼠PSMA阳性肿瘤的microPET显像和手术

靶向治疗的定点抗体片段-聚乙二醇-药物偶联物

开发了一种ADC设计策略：抗体片段-聚乙二醇-药物双结合(FPDC)。抗体片段的大小可以通过连接不同分子量的钉子来微调，从而提供了一个机会来精确地调整药代动力学-药效关系，以在较大的治疗窗口内实现最佳的临床结果。使用双反应氨基酸pTAF，预计可以有效地合成特定于聚乙二醇和一种药物的位点修饰的抗体片段。

图5 抗体片段-聚乙二醇-药物双重结合物的制备

图6 抗体片段-聚乙二醇-药物双偶联物的体内抗肿瘤活性

双ncAA掺入和三个相互兼容的生物正交反应制备位点特异性蛋白三偶联物

  作者为测试pTAF是否可以与其他具有生物正交性的ncAA结合，从而实现高效的蛋白质三重标记。选择pAcF，它是被用于制备目前正在进行临床试验的ADC，作为第二个与pTAF配对的ncAA。但是pAcF和PTAF的掺入条件并不是正交的，所以作者等人又设计和合成了mTAF。

  为了同时整合两个ncAA，分别在pULTRA62和pEVOL中构建了两对合成酶R2-74RS/tRN_AUA和pAcFRS/tRNA_CUA，并用它们共转化含有pET22bsfGFP-51TAA-151TAG载体的大肠杆菌BL21(DE3)。只有在mTAF和pAcF同时存在的情况下，才能有效地生产全长sfGFP。

  最后结果表明，相应的偶联物伴随着匹配的荧光团和分子量(20K聚乙二醇)移动，交叉反应很小，通过同时掺入pAcF和mTAF，双重掺入和三重标记策略可以有效地实现蛋白质的位点特异性三重标记。

图7 mTAF和pAcF在蛋白质中的位置特异性双重掺入进行三重修饰。

  综上所述，作者等人开发了一种方便、通用的平台，通过GCE将含有两个相互正交和生物正交反应基团的ncAA定点掺入，从而高产率地轻松获得蛋白质双重和多重共轭化合物。

本文作者：LRC

责任编辑：LRC

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-36658-y

DOI：10.1038/s41467-023-36658-y