摘要：酶促反应激发了许多化学家设计小分子模拟物，这些模拟物将在水性或非水性介质中发挥酶的功能。儿茶酚氧化酶（CO）和吩恶嗪酮合成酶（PHS）是自然界中的两种多铜酶，其导致Mn，Fe，Co，Ni，Cu的模型复合物。基于我们在该领域的早期工作，我们已经探测了上述金属的市售金属乙酸盐，以建立类似于两种酶的催化转化反应性的趋势。结果表明，Mn是用于类似催化的最佳三维过渡金属。发现乙酸锰可将3,5-二叔丁基邻苯二酚（DTBC）转化为3,5-二叔丁基醌（DTBQ），其中含有kcat=1.3（1）×103h-1并且对于邻氨基苯酚（OAP）至2-氨基苯并恶嗪酮（APX）转化为kcat= 111（2）h-1，证明了有效的CO和PHS活性。动力学研究表明，对于每种金属（II）乙酸盐，DTBC氧化遵循相对于底物的一级动力学，其活性级为Mn»Co> Cu>Fe≥Ni。通过机械研究，我们发现在DTBC氧化过程中检测到的活性氧主要是Mn，Fe和Co的羟基自由基，而Cu和Ni则产生H2O2

关键词：氧气激活、儿茶酚氧化、2-氨基苯并恶嗪酮、氧化C-C键耦合、金属醋酸盐、羟基自由基

1.介绍

生物氧化反应激发了金属配合物库的设计，在过去的几十年中，这导致了许多成功的酶功能模型[1-5]。这些复合物对于它们揭示原始酶的机制途径的能力变得重要。其中许多也被认为是有效的催化剂，尽管它们的活性与酶相比要少得多。小分子模拟物的优点是它们能够在有机溶剂中进行反应。金属酶可以在生理温和的条件下催化有机化合物与分子氧的转化[6-10]，但除非经过特殊改性，否则它们不能在有机溶剂中进行。因此，过渡金属配合物的设计和合成以及具有活化分子氧的能力是基于生物启发概念的绿色氧化催化剂的有吸引力的方法。

在酶携带的各种催化转化中，我们选择了与儿茶酚氧化酶（CO）和吩恶嗪酮合成酶（PHS）相似的催化转化，两种含铜的金属酶在本质上激发了我们和许多其他生物无机化学家设计模型复合物。CO将儿茶酚/二氧杂环戊烯氧化成相应的醌。发现基于醌的分子可用于设计用于抑制骨髓功能，抑制蛋白酶和产生抗癌剂的化合物。天然存在的醌类如metachronin，博利奈醌是有效的抗癌剂[11,12]。醌也是硫醇，硫化物，氰化物和胺类的有用清除剂[13]。 PHS催化取代的2-氨基苯酚与2-氨基苯并恶嗪酮发色团的氧化偶联（方案1），称为放线菌素，一种众所周知的抗肿瘤剂[14]。在各种方法中以不同的方式利用酶的性质，试图修复酶在表面上并通过多相催化进行有机转化是其中之一[15-19]。然而，将酶结合到固态载体上是繁琐的并且可能并不总是在有机溶剂中起作用以进行类似的转化。我们试图通过商业上可获得的金属乙酸盐在有机溶剂的实验室条件下进行类似于CO和PHS的有机转化（方案1），因为它们具有制药，染料和其他工业用途的潜力。

方案1.由儿茶酚氧化酶（CO）和吩恶嗪酮合酶（PHS）催化的氧化反应

世界各地的研究人员通过设计复杂配体系统的金属配合物[20-23]，为研究CO和PHS做了大量工作，并提供了关于这些酶的机理途径[21,22,24-26]的见解。金属盐，尤其是用作合成许多此类仿生复合物的前体的乙酸盐几乎没有被探测它们在这种催化中的效率[27-30]。起初看起来非常合理，因为酶活性位点的配位原子和几何形状与金属乙酸酯的结构无关。然而，由于金属盐被忽略，金属离子作为独立的作用和影响仍未得到探索。人们还可能会争辩说，探测金属乙酸盐是必不可少的，因为它会告诉我们当与金属络合时，配体会影响机械途径或产生的ROS多少。在我们在这一领域的努力中，我们碰巧得到了一种MnIII复合物，它为DTBC氧化提供了最佳的周转率，并且它具有OR型氧供体[31]。上述结果使我们认为需要研究金属乙酸盐在DTBC氧化中的效率。为了开始这一追逐，由于我们的成功是使用MnIII复合物，因此MnIII-乙酸盐是探测CO和PHS活性的明显首选。结果很有希望。使用2-氨基苯酚（OAP）作为底物形成2-氨基苯并恶嗪酮（APX）和具有103h-1的氧化转换的高效CO模拟物，MnIII乙酸酯被证明是用于PHS的最佳小分子模拟物之一。3,5-二叔丁基儿茶酚（DTBC）与3,5-二叔丁基苯醌（DTBQ）的比较[32]。

然而，我们仍然不知道经常用于CO或PHS的合成模型复合物的其余金属离子的活性。 因此，我们探测了一系列用于DTBC和OAP氧化的3d-过渡金属乙酸盐。从目前使用的3d-金属列表中选择金属，以使用不同的配体系统设计CO或PHS的模拟物。铜[24,33-54]，铁[25,55-57]，钴[58-65]，锰[66-79]，镍[26,68,80-83]和锌[33,84]。PHS模拟物不能像CO那样多，但用3d金属进行了很好的研究。 Co [85-92]，Mn [71,89,91,93]，Cu [94]，Fe [91,95]络合物使用2-氨基苯酚作为底物。 我们研究了每种金属离子可能存在的活性氧（ROS）。 我们选择金属乙酸盐而不是氯化物或硝酸盐，因为乙酸盐是不稳定的配体，可商购并且与DTBC和OAP溶剂相容。

这里介绍了MnII，FeII，CoII，NiII和CuII的三种氧化反应的比较研究，即DTBC氧化成DTBQ，OAP到APX和2,6-二叔丁基苯酚的氧化CC键偶合（2，6-DTBP）至3,3-5,5-四叔丁基二苯醌（DPQ）。我们发现虽然CuII恰好是酶CO和PHS中的首选金属。在金属乙酸盐的实验室中，MnII / III-乙酸盐是最有效的。CoII-和CuII-乙酸酯似乎接下来与用于将DTBC氧化成DTBQ的类似kcat一致但是参与该过程的ROS物质是不同的。在将OAP转化为APX时，MnII / III再次似乎是3d-过渡金属离子中最好的，并且CuII-乙酸酯的活性与FeII-和CoII-乙酸酯相当。在DTBC氧化过程中探测活性物质表明 DTBC也充当配体，并且在催化过程中乙酸盐全部从金属离子中除去。

2.实验

2.1.材料和方法

所有反应均使用HPLC级溶剂[甲醇（Merck），乙腈（Merck）]进行。所有乙酸金属（II）[例如乙酸锰（II）四水合物，乙酸铁（II），乙酸钴（II）四水合物，乙酸镍（II）四水合物，乙酸铜（II）一水合物]，3,5-二-叔丁基儿茶酚，二甲基亚砜（DMSO），（±）-生育酚，普罗布考，d / lp-氯苯丙氨酸，2-氨基苯酚，二氧化钛氧化钛二水合物均购自Sigma，无需进一步纯化即可使用。 3,5-二叔丁基苯醌也购自Aldrich，用于计算90：1乙腈，甲醇混合物中的摩尔消光系数（ε）.L-蛋氨酸，L-组氨酸[SRL（印度）]和氢氧化钠[默克（印度）]也按原样使用。根据先前报道的文献程序[96]合成甲硫氨酸和组氨酸的甲酯。在室温（25℃）下，在Bruker Avance III 500MHz或Jeol ECS400MHz光谱仪上记录NMR光谱。使用Varian Cary 300 Bio UV记录电子光谱，分析光度计。使用micromass Q-Tof microTM（Waters）通过正模式和负模式电喷雾电离记录电喷雾电离质谱。在Bruker BioSpin WinEPR光谱仪上记录X波段EPR光谱。

2.2.DTBC的催化氧化

通过使用石英比色皿（1.0cm路径长度）和配备有Peltier恒温附件的Varian Cary 300 Bio UV-vis分光光度计记录动力学研究的UV-vis光谱。所有动力学测量均在25℃的恒定温度下进行，用恒温器监测。在室温（25℃）有氧条件下，将乙腈中的DTBC加入到MII-乙酸酯的甲醇溶液中。最终比例为乙腈：比色皿中的甲醇为90：1v/v。对这些反应混合物产生吸光度与波长的关系曲线，以300-700nm的5分钟的规则时间间隔记录分光光度数据。为了确定速率和各种动力学参数的底物浓度依赖性，用100-800M当量的DTBC处理10-4-10-6M催化剂溶液，并如上所述监测吸光度。对于MnII-乙酸酯，使用10-6M催化剂浓度进行动力学实验，而其他金属乙酸盐在如此低的浓度下不具有活性。因此，对于CoII和CuII乙酸盐，我们使用10-5M浓度，而对于FeII和NiII乙酸盐，使用甚至更高浓度（10-4M）的催化剂。通过使用米氏，双倒数和Eadie-Hofstee图确定动力学参数。产物（DTBQ）也通过ESI-MS和NMR光谱表征。1H NMR（400MHz，CDCl3）：δ= 6.93（d，1H，J = 2.28Hz），6.21（d，1H，J = 1.52Hz），1.26（s，9H），1.22（s，9H）ppm;13C NMR（100MHz，CDCl3）：δ= 181.26（C-1），180.17（C-2），163.46（C-3），150.07（C-4），133.60（C-5），122.22（C- 6），36.16（C-7），35.61（C-8），29.34（C-9），28.01（C-10）ppm。ESI-MS阳离子模式：m / z = 243.14 [（DTBC + Na+）]+（计算值243.14）。数据显示只有DTBQ由DTBC组成。没有获得其他副产品。

2.3.在DTBC氧化催化反应中检测过氧化氢

通过两种不同的方法探测了DTBC催化氧化过程中过氧化氢的形成，可以通过在碘化钾的情况下在352nm处产生特征峰来检测H2O2。为了在DTBC氧化后检测过氧化氢，将DTBC在乙腈和甲醇混合物中用1mol％MII乙酸酯氧化2小时。然后使用二氯甲烷将形成的DTBQ萃取三次。然后使用稀释的H2SO4将水部分酸化至pH2，并用100nM辣根过氧化物酶向其中加入三分之一体积的KI溶液（500mg / 10mL）的水溶液。监测在I3-离子特征的352nm波段的外观。仅使用H2O2溶液和大气氧（不含催化剂或DTBC）进行对照实验。

还可以通过使用草酸钛（IV）草酸盐形成TiIV-过氧物质来检测H2O2的形成。在该实验中，DTBC氧化和萃取程序的催化反应与上述方法相同。向分离的含水部分中加入1mM草酸钾（IV）溶液，以监测条带为379nm，由于TiIV-过氧键的形成[97,98]。还使用过氧化氢进行对照实验。

2.4.催化氧化2-氨基苯酚（合成2-氨基苯并恶嗪酮或APX）

通过在甲醇中加入OAP（109.0mg，1.0mmol）和MII乙酸盐（0.01mmol）（MII= MnII，FeII，CoII，NiII，CuII）进行邻氨基苯酚（OAP）的氧化，然后搅拌反应混合物 12小时从溶液中沉淀出纯产物，将其过滤，收集。通过ESI-MS，1H NMR和13C NMR表征产物。ESI-MS（+ ve离子模式）：m / z= 213.08 [（APXH）]+（计算值213.07）; m / z =235.05 [（APXNa）]+（计算值235.05）; m / z =251.03 [（APXK）]+（计算值251.02）。1H NMR（500MHz，Me2SO–d6）：δ= 7.71（dd，1H，J = 7.5Hz，ArH），7.44（m，2H，ArH），7.39（m，1H，ArH），6.80（br，s，2H），NH 2），6.36（s，2H，ArH）ppm。 13C NMR（125MHz，Me2SO-d6）= 180.2（C-3），148.9（C-10a），148.2（C-4a），147.3（C-2），141.9（C-5a），133.7（C -9a），128.8（C-7），127.9（C-9），125.3（C-8），115.9（C-6），103.4（C-1）和98.3（C-4）ppm。

在MnII乙酸盐存在下有氧氧化OAP至APX的动力学通过监测吸光度随430nm（ε= 22×103M-1cm-1）的时间变化来测量，这是2-氨基苯并恶嗪的特征-3-酮。所有动力学测量均在25℃的恒定温度下进行，用恒温器监测。为了确定底物浓度对速率和各种动力学参数的依赖性，用500,1000,1500,2000,2400,3000,3200和3400M当量的OAP处理5M催化剂溶液，并如上所述监测吸光度。对这些反应混合物产生吸光度对波长图，以300nm的范围内以5分钟的规则时间间隔记录分光光度数据。比色皿中乙腈：甲醇的最终比例为90：1v / v。通过使用Michaelis'senten plot和双倒数作图法确定动力学参数。

表一. 将DTBC氧化到DTBQ的动力参数

2.5.2,6-二叔丁基苯酚的氧化CC偶联（2,6-二叔丁基苯酚转化为-3,3-5,5-四叔丁基二苯醌）

通过在甲醇中加入2,6-DTBP进行2,6-二叔丁基苯酚（2,6-DTBP）的氧化偶合，向其中加入氢氧化钠水溶液，使得总浓度为10mol％。加入上述溶液MII乙酸盐（0.01mmol）（MII = MnII，FeII，CoII，NiII，CuII）的甲醇溶液，将混合物在25℃下搅拌4-24小时。 在加入MII乙酸盐溶液一小时后，产物开始形成红色沉淀。反应完成后，过滤收集产物，用甲醇洗涤干燥。通过TLC发现产物是纯的，因此通过ESI-MS和1H NMR光谱分析干燥的产物.ESI-MS（阳离子模式）：m / z = 409.30 [（DPQH）] +（计算值409.31）; m / z = 431.29 [（DPQNa）] +（计算值431.29）。1HNMR（500MHz，CDCl3）：δ= 7.71（s，4H），1.36（s，36H）ppm。

2.6.质谱

使用Waters Q-Tof微质谱仪记录ESI质谱数据。使用（1：1）乙腈，甲醇混合物进行儿茶酚氧化的质谱研究。ESI-MS用1:50的MII乙酸盐与DTBC的混合物进行，所述DTBC具有10μM浓度的MII-乙酸盐。使用更高的催化剂比率以获得形成的各种金属结合物质的良好信噪比。催化产物的ESI-S也用10μM储备溶液进行。

3.结果与讨论

3.1.儿茶酚酶活性研究

儿茶酚氧化酶（CO）是含有双核CuII的酶，具有3型活性位点[99]，催化儿茶酚氧化成醌。在几种模型系统的帮助下，已经阐明了CO的结构和功能方面[24,49,68,71,81,82,84,100-102].此外,对模拟物的研究导致了几种替代的氧化机制[20-22,46,103-105]。在儿茶酚酶活性的模型研究中，DTBC通常用作底物，因为庞大的基团防止过度氧化，例如开环[106-108]，并且还显示出在大约100℃时吸光度显着增加。 随着氧化物质（DTBQ）的形成而增加400nm。

我们使用前面提到的六种过渡金属乙酸盐的10-4-10-6M溶液进行了DTBC氧化的动力学和机理研究。我们发现，在我们尝试的六种金属乙酸盐中，只有ZnII乙酸盐是无活性的，而另外五种（MnII，FeII，CoII，NiII和CuII-乙酸盐）是活性的。氧化还原无活性的ZnII乙酸盐被认为是催化失活的，这证实了我们的结果。对于特定的催化剂 - 基质混合物，速率由ΔA对时间曲线的初始斜率（400nm处的吸光度变化）计算，使用高达800M当量的DTBC并通过米氏方程式分析，Lineweaver-Burk和Eadie-Hofstee图[109]（表S1和图S1）和产物DTBQ的纯度通过NMR和ESI-MS研究进一步证实（图S2-S4）。在所有三种情况下，获得的动力学参数彼此良好匹配。基于三个拟合数据，表1中显示了转换数（kcat）和其他动力学参数，其反映了MnII乙酸盐是其中最有效的催化剂，其kcat为1.3（1）×103h-1（图1）。 MnII-乙酸酯的kcat优于大多数设计的模拟物，并且与我们之前报道的MnⅢ-乙酸酯（kcat = 1.72（2）×103h-1）[32]的顺序相同。这表明，对于这种特定目的，Mn在3d-过渡金属中是最有效的。为了这个目的，大自然并没有回收Mn，而是选择了铜，尽管在地壳或海床中锰的含量高于铜[110,111]。一个原因可能是自然难以在该配体环境中掺入Mn并指导其功能以特异性氧化儿茶酚。

图1.由MnII乙酸盐催化的DTBC氧化的初始速率与底物浓度的关系图。插图显示了Eadie-Hofstee情节

事实上，已知MnII / III乙酸盐也可以进行其他氧化反应[112-115]。因此，两种金属离子的电子性质的差异即。氧化还原电位，蛋白质产生的某种几何形状的稳定性，进行其他反应的能力导致Cu的选择。结果强调，作为金属离子有效用于某种目的并且仅仅丰富并不一定使其适合掺入蛋白质活性位点。尽管CuII乙酸盐（kcat = 0.2（1）×102h-1）的活性低于MnII乙酸盐（kcat = 1.3（1）×103h-1），但自然界已选择CuII作为CO的活性位点。另一方面，CuII乙酸盐和乙酸CoII（kcat = 0.3（1）×102h-1）具有与CO活性相似的kcat，但KM值不同。 kcat / KM的比例实际上预测了生物模拟反应的最佳催化剂[35,45,52]。在我们的例子中，计算表明MnII / III具有大约106M-1h-1的kcat/ KM值，并且下一个最好的是大自然选择CuII，kcat / KM为105M-1h-1。探测到的其他3d金属（Fe，Co，Ni）比CuII-乙酸盐少至少两个数量级。看来尽管存在许多用于CO活性的优异NiII催化剂，但是在NiII的情况下，配体的重要性非常受欢迎，因为即使在10-4M浓度下，NiII乙酸酯本身也具有非常低的转换数（表1）。即使在10-4M浓度下，FeII-乙酸酯也具有低kcat，并且从文献中可以看出，没有太多尝试使用FeII基复合物作为CO的模拟物[25,55-57] .FeII / III似乎基于文献数据[116-123]，儿茶酚双加氧酶（导致二醇或二醇裂解）是更好的选择。因此，两种金属离子Mn和Cu可以提供一个很好的例子来说明“适应规则”如何导致酶活性位点中金属离子的排斥。

在这项工作中，我们并不打算说金属乙酸盐对催化反应具有特异性。事实上，我们知道在这项工作中使用的金属乙酸盐也可以催化许多其他反应。我们的结果表明，金属乙酸盐如何能够有效地进行类似于酶的反应，并可能帮助我们选择金属来进行类似的反应。实验室金属乙酸盐还可以根据特定反应的氧化还原活性，更深入地了解酶活性位点金属选择的合理性。该反应性知识可用于设计更好的生物催化以进行类似的反应。值得注意的是，并非所有蛋白质/酶在体外都具有选择性。没有特定条件的酶和它们周围的协调环境可能是非选择性的。黄原胶氧化酶可在氧气存在下产生超氧化物[124,125]，卤过氧化物酶可催化磺化氧化[126]，酪氨酸酶可发挥儿茶酚酶活性[127,128]和吩恶嗪酮合酶活性[127,128]，漆酶也可进行吩恶嗪酮合酶活性[129,130]，固氮酶可以减少不饱和烃底物，氰酸酯，硫氰酸盐[131,132]。尽管酶CO的大多数模型复合物都是铜络合物，但仔细观察Mn络合物表明Mn络合物表现出良好的催化效率，总体上优于任何其他探测金属络合物，表明Mn对于实验室和工业中的类似活性是最佳的。

 表2  MII乙酸盐催化的DTBC氧化抑制百分比（％）（MII = MnII，FeII，CoII，NiII，CuII）。 两个独立实验的平均值列表（较少超过10％的抑制被忽略）

3.2.抑制儿茶酚酶活性

探讨了所有使用的活性金属乙酸盐的DTBC氧化的机理途径。机械途径的一个重要部分是催化过程中涉及的ROS类型。我们在反应混合物中使用不同的抑制剂来检查它们对反应速率的影响，这反过来提供了对可能的ROS的洞察。通常，我们在催化剂浓度方面使用了10当量的抑制剂。用于DTBC催化氧化的抑制剂是（卤） - 生育酚（单线态氧猝灭剂）[133,134]，普罗布考（过氧化物和超氧化物猝灭剂）[135,136]和DMSO（羟基自由基抑制剂）。这些抑制剂的作用如表2所示（图S5）。所有金属乙酸盐的一个常见结果是氨基酸抑制儿茶酚氧化能力。使用10M当量的甲硫氨酸甲酯或组氨酸甲酯显示完全抑制DTBC的氧化。这与我们早期对其他CO模型复合物的研究非常一致，这些研究表明氨基酸的氨基或甲酯是儿茶酚氧化的潜在抑制剂，因为它们与底物（DTBC）或与氧结合以与催化剂竞争抑制氧化过程[31,32,137]。

3.3.评估ROS种类

在金属还原时DTBC氧化期间，分子氧的存在将导致金属离子的氧化，其中氧被转化为ROS。然而，取决于可用于ROS的电子数量，可以转化为水或保持为过氧化氢。在主要的机制途径中建立了产生两个醌和水分子的途径，这是儿茶酚氧化酶最常被接受的途径。然而，只有很少的模型系统遵循这一途径[138-141]。 已知大多数设计的催化进行儿茶酚氧化的络合物通过交替途径进行氧化，其涉及醌与H2O2而不是水的生产[24,34-36,52,53,76,140,142-145]。在我们的案例中，使用KI溶液和辣根过氧化物酶[53,140]以及使用草酸钛（IV）草酸盐[97,98]测试了作为最终产物的过氧化氢的存在或不存在。

图2.过氧化氢检测试验的紫外-可见光谱，显示在379nm附近的特征峰，用于在草酸钛（IV）存在下通过H2O2产生TiIV-过氧配合物。还显示了使用H2O2作为标准的控制谱

对于CuII和NiII乙酸盐，检测到过氧化氢作为DTBC氧化的副产物，而对于其他三种乙酸盐（MnII，FeII和CoII），H2O2未被检测为最终产物（图2和S6）。文献调查表明，H2O2的形成很大程度上取决于催化过程中涉及的金属中心。在大多数模型研究中，ROS检测测试没有按照文献数据进行，但是在已经进行的情况下出现趋势。 MnII/ III / IV系统总是产生水而不是H2O2。可能有人认为Mn会分解H2O2 [76]因此无法检测到，但之后我们已经检测到过氧化物用于Mn基催化剂[31]。对于NiII/ III CO模拟物，总是发现H2O2是DTBC氧化的最终产物[26,80-82,146]，对于Cu的模型络合物也是如此[24,53]。还知Co和Fe配合物分解H2O2[147-150]。虽然我们没有得到H2O2作为最终产品，但是我们在抑制剂存在下使用紫外-可见光谱的机理研究表明，普罗布考通过FeII和CoII抑制DTBC向DTBQ的转化在15％，表明产生过氧中间体可能被金属中心消耗。虽然有一些CuII模型复合物，它报告了DTBC氧化过程中水的产生，但预测是在没有任何实验证据的情况下进行的[103,138]。因此，根据我们的研究和文献证据，似乎CuII和NiII产生H2O2。Mn产生H2O，Fe和Co产生H2O2，其在金属存在下快速分解并且不能被检测到。结果表明蛋白质协调在改变机制途径中的重要性。尽管CuII在大多数CO模型复合物中产生H2O2并且作为乙酸[24,34-36,52,53,140]，但在蛋白质活性位点中已知产生水[21,103]。

3.4.催化过程中的形态

EPR研究显示在DTBC氧化MnII，FeII，CoII，CuII乙酸盐期间g≈2.00的弱信号（图S7）。 该信号是在催化过程中形成有机自由基物种（DTBC的半醌）作为反应中间体的特征。 文献数据也与我们的研究非常一致，表明在这些配合物中使用的3d-金属存在下形成半醌中间体[20,26,61,62,67,80,137,146,151]。

方案2. DTBC氧化的合理机制

为了进一步了解可能的中间体的性质，用MII乙酸盐和DTBC（1:50）在甲醇中的催化反应混合物进行负离子模式的电喷雾电离质谱（ESI-MS）研究。在混合MII乙酸盐和DTBC的5分钟内记录ESI-MS谱。观察到的和模拟的图案如图1和图2所示，S8-S13。在所有情况下都观察到类似物种的形成，其中两个DTBC单元作为[MII（DTBC）（DTSQ）] -连接到金属中心。数据表明，在溶液中，金属乙酸盐产生单体金属-DTBC络合物，其有助于将DTBC催化成DTBQ。因此，底物也充当溶液中的配体。当仔细使用时，ESI-MS是一种软技术，似乎提供了有关反应溶液的有用数据。我们选择ESI-MS阴性模式，因为底物是二阴性儿茶酚，其可以提供与二正电荷的金属离子的多重结合，因此所得物质被认为是阴性的。

一旦我们结合从UV-vis研究，ESI-MS和EPR获得的证据，结果表明Mn，Fe和Co在氧气存在下通过产生羟基自由基氧化DTBC，而Ni和Cu通过产生过氧化氢氧化DTBC。 因此，我们提出了机理途径，其中金属与基质形成双/三螯合物，随后基质被氧化成醌，然后离开金属中心。通过这种方式，底物也可以作为配体，通过取代不稳定的乙酸酯形成活性催化物质（方案2）.EPR研究提供了有机基团，半醌中间体的证据，因此我们在所有情况下的命题，除Ni.NiII 反应非常慢，因此在任何时候半醌中间体的量可能不足以在EPR中获得良好的信号。锰似乎与本研究中研究的其他金属离子不同。

表3 使用MII乙酸盐（MII = MnII，FeII，CoII，NiII，CuII）将OAP氧化成APX

反应条件：OAP（1mmol），空气中的催化剂（1mol％），25℃。分离产率

我们之前发现了MnIV的参与[32]，这得到了文献证据[152-155]的强烈支持。现在，当我们开始使用MnII醋酸盐时，似乎MnII↔MnIII对在氧化还原过程中是活跃的，因为获得的证据表明由于可接近的氧化态，Mn在氧化DTBC中的多功能性。

3.5. 2-氨基苯酚（OAP）的氧化偶联

吩恶嗪酮生色团的合成在催化中变得重要，因为它作为抗生素放线菌素-d的生物合成中间体被抗生素链霉菌使用酶吩恶嗪酮合成酶（PHS）[156-160]发生[156-160]。 放线菌素-d通过抑制DNA指导的RNA合成起作用，并且临床上用于治疗某些类型的癌症[161-163]。 含有吩恶嗪酮的化合物也越来越受到各种工业应用的关注。 作为抗真菌和抗菌剂，染料[164]和开发荧光探针用于检测羟基自由基和活细胞成像[130,165-166]。

在实验室中，邻氨基苯酚（OAP）氧化转化为2-氨基苯并恶嗪酮（APX）已被用作PHS酶行为的模型。众所周知，天然酶需要4-5个铜中心才能获得最大活性，而较少数量的铜中心会降低活性[156]。然而，PHS的模型复合物大多是相当简单的过渡金属单核配合物[71,85-95,167]。仅有一篇关于四核CuII复合物的报道，作为Mukherjee等人的吩恶嗪酮合酶的模型。在该报告中，由于其氧化还原非无害性，配体也被认为对活性很重要[94]。基于文献数据，似乎单核金属配合物可以模拟PHS的功能活性，即五核铜（II）酶。在本报告中，我们表明，如果不设计任何新配体，而是在室温下使用市售的金属乙酸盐，我们可以将OAP转换为APX或DTBC转换为DTBQ.

我们检测了MnII，FeII，CoII，NiII，CuII金属乙酸盐的OAP氧化能力。 使用1mol％在甲醇中的催化剂在25℃下进行氧化反应（表3），并通过NMR和ESI-MS表征并确认最终产物（图14-S18）。 同样，MnII乙酸盐的活性优于本研究中使用的其他金属乙酸盐。早些时候我们发现MnⅢ-乙酸酯在PHS的模型复合物中表现出最高的周转率。现在，在探测了一系列用于模拟PHS的3d过渡金属之后，我们发现Mn排在首位。自然界的选择Cu对PHS活性的活性似乎低于Mn.MnII-乙酸酯即使在室温下也能将OAP转化为APX，尽管产率几乎降低到一半（表3）。

Mn的最佳性能使我们通过监测430 nm处吸光度随时间变化的变化，对其有氧OAP氧化成APX进行了详细的动力学研究（ε=22×103M-1cm-1，2-氨基恶嗪-3-1的特征）。详细的动力学研究揭示了相对于底物（OAP）的一级动力学（图3），kcat值为111（2）h-1。我们还对使用紫外光谱法进行OAP氧化的可能的活性氧（ROS）进行了初步调查。研究表明，与DTBC氧化不同，羟基自由基可能不参与此情况，因为反应速率不受DMSO的影响，DMSO是羟基自由基的强抑制剂。该反应也几乎不受其他ROS猝灭剂的影响。即（±）-α-生育酚或普罗布考（图S19），表明可以排除超氧化物，过氧化物和羟基自由基。甲硫氨酸酯完全抑制反应，表明底物与催化剂的配位对于活性是必需的。我们早期的工作表明，氨基酸或它们的酯与金属中心配位，阻止了与DTBC或氧的反应[31,32,137,168]。

图3.由MnII乙酸盐催化的OAP氧化的初始速率与底物浓度的关系图。插图显示了Lineweaver-Burk情节

 这项工作的结果表明，对于CO或PHS活性，甚至氧供体配体的Mn可能是最好的。然而，大自然选择‘Cu’而不是‘Mn’可能是因为酶位点的“适合度”。CO或PHS中金属中心周围的环境和建议的几何形状可能不支持MnII / III的掺入，因为结合的Mn的稳定性降低，并且其可能在至少三种氧化态（II-IV）之间切换并执行使用蛋白质的可用关节配体环境的其他反应。

3.6.2,6-二叔丁基苯酚的氧化CC键偶联（2,6-DTBP）

碳-氢键活化方案允许利用CH键作为官能团，为产生碳-碳和碳-杂原子键提供直接途径。金属乙酸盐在DTBC中形成半醌和OAP氧化的成功以及DTBC附着在作为配体和底物的金属上的事实表明，值得努力探索空间位阻2,6-DTBP的氧化偶联。通常与4d和5d过渡金属催化剂（即Pd，Ru）相比，3d-过渡金属相对不太受碳-氢键活化的影响[169-177]。第一排（3d）过渡金属如Fe，Co，Ni，Mn或Cu相对较少使用[178-184]。

各种研究小组已经研究了使用分子氧氧化2,6-DTBP [185]。 H2O2或tBuOOH作为氧化剂，得到两种不同的氧化产物3,3-5,5-四叔丁基二醌（DPQ）和2,6-二叔丁基苯醌（BQ）[190,191]。 在3d-过渡金属中，有更多的铜[185,186,190,192]和钴盐和络合物[188,193  -202 ]作为催化剂的例子，但铁和锰的使用相对较少[76,187,203]。有机配体也被发现是形成DPQ作为主要产物的有效催化剂[204]。还发现在碘存在下过氧化氢导致BQ的选择性形成[205]。

表4 使用MII乙酸盐（MII = MnII，FeII，CoII，NiII，CuII）将2,6-DTBP氧化成DPQ

 反应条件：2,6-DTBP（1mmol），催化剂（1mol％）和NaOH（10mol％），在空气中，25℃。

a.孤立的产量。

b.没有NaOH

通过将2,6-DTBP溶解在甲醇中，然后加入10mol％氢氧化钠水溶液，然后向其中加入1mol％MII-乙酸酯，进行2,6-DTBP的催化氧化。将反应混合物在25℃下搅拌4-24小时。 随着反应的进行，DPQ明显地见为红棕色沉淀物，最后通过过滤收集并干燥并通过ESI-MS和NMR光谱分析纯度（图S20-S21）。在使用的六种MII乙酸盐中，仅发现MnII，CoII，CuII是活性的（表4）。 CuII乙酸酯显示出一个明显的例外;它不需要加入碱，它是活性的，没有添加任何碱，并且即使在加入优化的10mol％NaOH后产率也没有太大变化。根据文献证明OH的去质子化是第一步[190,206]，由于其较高的路易斯酸性，Cu似乎能够通过与酚氧的相互作用使酚OH去质子化。

4.结论

使用金属乙酸盐对CO和PHS活性的研究表明，Mn是最活泼的金属离子，并且底物可以充当配体以形成活性催化物质。似乎负责CO氧化的活性物质是在反应过程中形成的双或三 -儿茶酚结合的金属-儿茶酚酸盐络合物。我们之前关于MnIII醋酸盐[32]的研究也证实了这一点，我们可以找到三种DTBC的结合。早期使用取代的儿茶酚作为配体，使用Mn，Co，Fe和Cu作为金属离子，也支持类似物种的形成[152-155,207-210]。似乎Mn是金属的最佳选择，需要用合适的配体进行更多探索以调节活性。Mn-乙酸酯显示羟基自由基的参与，而CoII和FeII显示过氧和羟基自由基的参与。相比之下，虽然酶的良好建立的机理途径显示没有过氧化氢的参与，但显然，CuII（CO和PHS的天然金属）通过产生过氧化氢氧化DTBC。因此，蛋白质供体在改变金属离子的机理途径中的影响似乎也很明显。此外，Mn似乎也是用于将2-氨基苯酚转化为2-氨基苯并恶嗪酮的3d-过渡金属中最佳的金属。此外，Mn对2,6-二叔丁基苯酚（2,6-DTBP）的氧化偶合也最有活性。然而，CuII作为催化剂的存在不需要碱的存在。上述偶联反应还暗示了对于CO和PHS蛋白的CuII的自然选择，因为除了几何约束之外，自然可以利用Cu的路易斯酸性来结合和活化相应的底物。

致谢

我们感谢CSIR-India为资助项目01（2475）/ 11 / EMR-II提供资金。 我们还要感谢IISER Kolkata的财务和基础设施支持。SKD希望感谢印度新德里C.S.I.R的研究奖学金。

原文标题：《Investigation of 3d-transition metal acetates inthe oxidation of substituted dioxolene and phenols》

原文出处：Journal of Molecular Catalysis A: Chemical 407 (2015)93–101

涉及二氧杂环戊烯和苯酚氧化反应